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BioTNT 甲基化檢測技術服務
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BioTNT 甲基化檢測技術服務


 

      DNA突變會導致表型改變。然而,序列不變化,基因調控照樣能發生,這就是表觀遺傳學的威力。DNA甲基化是表觀遺傳學中的重要組成部分,在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育中起著重要作用,也與多種癌癥密切相關。

  脊椎動物的DNA甲基化通常發生在CpG島中的胞嘧啶。CpG島是CpG二核苷富集區域,GC含量大于50%,長約200-500 bp。甲基化是由DNA甲基轉移酶所催化的,將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶(5mC)。這樣一個簡單的生化反應卻有著意想不到的嚴重后果。許多重要的過程如胚胎發育和細胞周期調控都與甲基化息息相關,而多個癌癥也表現出異常的甲基化模式。甲基化的存在就像一個開關,在不需要基因表達的時候將基因的活性關閉;去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。

5-羥甲基胞嘧啶5-hydroxymethylcytosine(5-hmc)的分子式是C5H7N3O2,是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)的羥基化形式,5-羥甲基胞嘧啶是TET家族的酶通過氧化5-甲基胞嘧啶(5-mC)產生的,被稱為“第六種堿基”,可以調控基因表達的關閉,是一種重要的表觀遺傳修飾,可能與去甲基化過程有關,5-羥甲基胞嘧啶的具體作用機制還不明確。

甲基化是蛋白質和核酸的一種重要的修飾,調節基因的表達和關閉,與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關,是表觀遺傳學的重要研究內容之一。 最常見的甲基化修飾有DNA甲基化組蛋白甲基化。

由于普遍認為DNA甲基化在多種疾病尤其是癌癥中扮演著重要的角色,所以人們對表觀遺傳學研究寄予厚望,希望能從中發現新的診斷和治療的生物標志物。

 

DNA甲基化研究有以下兩大類實驗路線,BioTNT 對此進行了以下比較:

 

前期處理

是否可定量

適用性

引物設計難度

數據表示

甲基化敏感性限制性酶切+QPCR

酶切

中等樣本+CPG

柱狀圖和數值

5-hmc+5-mc 酶切+QPCR

酶切

中等樣本+CPG

柱狀圖和數值

亞硫酸鹽測序

亞硫酸鹽處理

少量樣本

測序報告,克隆統計

MSP+QPCR

亞硫酸鹽處理

大批量樣本

擴增圖片或數值

HRM

亞硫酸鹽處理

半定量

大批量樣本

數據

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第一類: 不進行亞硫酸鹽處理,對樣本進行酶切;

實驗方法:采用樣本抽提DNA 后,應用位點特異的甲基化酶和非甲基化酶進行樣本的剪切,避免了亞硫酸鹽處理;

后期采用QPCR 方式,對CPG 島進行定量檢測;

可以得到甲基化和非甲基化的含量比例;主要適用于少量樣本,多位點的檢測;

 

運用不同試劑盒,通過后期實時 PCR 數據用于確定 5-羥甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的數量。結果顯示了所選組織中 5-羥甲基胞嘧啶水平的變化。

代表產品: Qiagen 甲基化PCR Array;

NEB 5-hmc 和5-mc 定量檢測;

Biotnt 提供您進行甲基化CPG 島甲基化含量和非甲基化含量檢測的技術服務;

收費情況如下:

1. 樣本抽提和處理費用,300元/樣本;

2.單個CPG 島,費用為150元/八孔雙復數據;

 

新方法推薦:

不進行亞硫酸鹽處理,對樣本進行酶切,采用樣本抽提DNA 后,應用位點特異的甲基化酶和 非甲基化酶進行樣本的剪切,避免了亞硫酸鹽處理;

后期采用QPCR 方式,對CPG 島進行定量檢測;

可以得到甲基化和非甲基化的含量比例;主要適用于少量樣本,多位點的檢測;

第一種方法,運用不同試劑盒,通過前期不同酶的處理,以及后期實時 PCR 數據用于確定 5-羥甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的數量。結果顯示了所選組織中 5-羥甲基胞嘧啶水平的變化。

 

第一種:限制性酶切產物+QPCR 分析甲基化和非甲基化水平:

推薦一:采用Qiagen  EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (12)試劑盒,可以通過準備您的基因組DNA 樣本,進行后期的QPCR;

使用試劑盒中提供的消化液,進行4種消化;methylation-sensitive restriction enzyme (Enzyme A),消化的是甲基化位點;methylation-dependent restriction enzyme (Enzyme B) 消化的是非甲基化的DNA 序列;

推薦二:采用Biotnt 甲基化DNA 限制性酶切試劑盒,可以通過準備您的基因組DNA樣本, 進行后期的QPCR;

通過檢測(M0, Mu, Mm,Mum)的CT 值,可以計算出M% 和U%。

 

//www.oriongenomics.com/images/tech-ca-clinical-assays.gif

 

第二種:獨特方法!

可以同時檢測5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)5-甲基胞嘧啶(5-mC)的實驗方法:

采用5-hmC 和 5-mC 分析試劑盒,能對特定 DNA 位點內的 5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)和 5-甲基胞嘧啶(5-mC)進行定性及定量。這種酶學方法包括三步簡單操作,利用了同裂酶 MspI 和 HpaII 對甲基化敏感性的不同。

簡述三步操作如下:基因組 DNA 用 T4 噬菌體β-葡糖基轉移酶和 UDP-葡萄糖處理,將所有的 5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)糖基化;用限制性內切酶 MspI 和 HpaII 消化 DNA,這兩個同裂酶有不同的甲基化敏感性;然后用終點或實時 PCR 來定性和定量不同的甲基化狀態。試劑盒的設計目的是簡化甲基化分析,增加發現新生物靶標的可能性。

特性

定量分析基因座內的5-hmC 5-mC,重復性好

簡單明了的實驗步驟

與現有 PCR 技術相兼容

可用于高通量用戶

 

//www.neb-china.com/userfiles/E3317-2.png

5-hmC 5-mC 分析試劑盒分析 Balb/C 小鼠組織樣品(基因座 12)不同的甲基化狀態。A)用于甲基化分析的 6 個不同反應的終點 PCR。虛線框中的泳道顯示了 5-羥甲基胞嘧啶的存在。B)實時 PCR 數據用于確定 5-羥甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的數量。結果顯示了所選組織中 5-羥甲基胞嘧啶水平的 

實驗方法和實驗步驟:

1. 抽提DNA試劑盒;

2. 5-hmc 和5-mc 的處理試劑盒, 原理: 同一份樣本分成三份, 按照說明, 5-hmc 可進行糖基化; 甲基化敏感的限制性內切酶進行剪切;甲基化不敏感的限制性內切酶進行剪切; 經過這個步驟,后期樣本進行QPCR 檢測 ; 每個樣本處理費用為300元;8個樣本起做;

1個CPG 島實驗費用為1500元 8個樣本;

 

實驗步驟:

1.  樣本的基因組DNA 抽提;

2.  1份樣本分成三份,進行不同的酶切處理;

3.  您要檢測的基因CPG 島查詢; 1個CPG 島 設計一對引物, 每份樣本進行QPCR雙重復擴增; 

4. 正式實驗: 每個樣本,抽提,酶切處理,1個CPG 島的QPCR, 為樣本分為四份的實驗方法, 雙重復實驗(共8孔);樣本前期試劑費用為300元/樣;1個CPG 島的檢測費用為150元/樣本;同一份樣本,要增加一個CPG 島,每個樣本增加150元/樣本;

 

實驗結果顯示方式:

樣本

5-hmc 含量百分比;

5-mc 含量百分比;

UM(未甲基化)含量百分比;

 

 

第二類:亞硫酸鹽處理后進行后期的檢測分析:

樣本的采集和穩定,基因組DNA 純化,亞硫酸氫鹽轉化及CpG位點的甲基化檢測。

后期檢測分為:

1.  亞硫酸鹽測序;

2.  MSP(甲基化PCR)檢測;

3.  高清溶解曲線

 

2.1    亞硫酸鹽測序:

實驗步驟:

l  基因組DNA的提??;

l  BSP實驗亞硫酸鹽處理及純化(QIAGEN,cat59824

l  引物的設計加粗斜體下劃線部分為引物位置,紅色字體區域為檢測區域)PCR產物

l  PCR擴增;反應程序

l  T/A克隆與測序:PCR產物純化,連接T載體,轉化酶切法鑒定陽性菌落,挑取質粒送測序(10個克?。?;

l  實驗結果:

1. DNA 質量鑒定,Nano 數據,

2. DNA 完整性電泳圖片;

B119-DNA

3.PCR 產物電泳圖片;

 

 

 

 

4.測序分析結果:

 

2.2    特異位點的甲基化PCR(MSP)

   2.1采用基因組DNA 提取試劑盒,抽提基因組DNA;

2.2采用硫化處理試劑盒:epigentek,對樣本進行硫化處理 ;

2.3 后期采用QPCR 方式或者電泳方式進行產物的檢測;

  

甲基化特異性PCR(MS-PCR)

 這種方法經濟實用,是目前應用最為廣泛的方法。在亞硫酸氫鹽處理后,即可開展MS-PCR 或者MS-real time PCR。MSP方法中,通常設計 兩對引物,一對MSP引物擴增經亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板,而另一對擴增未甲基化片段。若第一對引物能擴增出片段,則說明該檢測位點存在甲基化,若第二對引物能擴增出片段,則說明該檢測位點不存在甲基化。MS- Real time PCR與上面的原理相同,設計的引物,進行real time PCR 檢測,通過CT值,擴增曲線和溶解曲線進行實驗結果的判斷;

如果樣本中同時存在甲基化 和非甲基化的DNA 模版,則通過CT 值 和Delta CT 值,可以計算出甲基化DNA 樣本在總樣本中含量。

BioTNT MS- real time PCR 技術服務:設計MS-real time PCR 引物;合成;預實驗;

計算樣本中的甲基化含量。

 BioTNT 技術服務部提供MSP-QPCR實驗解決方案:

1、您的樣本可以是全血、血漿、血清、細胞或者組織;

2、采用專為亞硫酸鹽轉化提供最佳質量的基因組DNA的抽提試劑盒,為您提取高質量的基因組DNA;

3、BioTNT 技術部豐富的實驗經驗為您進行亞硫酸鹽的轉化;

4、客戶提供引物M 引物和U引物,或者由BioTNT 設計引物M引物和U引物;

5. 客戶提供樣本以及陽性對照和陰性對照,用相應引物進行實驗;

6、好的MSP 引物(M 一對,U一對),進行real time PCR 實驗;

7、MSP 引物,可以進行大批量實驗,計算樣本中的甲基化樣本含量;

 

方法的局限性:部分位點由于序列的原因,難以設計合適的MSP 引物;

 

2.3    亞硫酸鹽處理+高清溶解曲線檢測

在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物,這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發生了甲基化,用亞硫酸氫鹽處理后,未甲基化的胞嘧啶經PCR擴增后轉變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變,樣品中的GC含量發生改變,從而導致熔解溫度的變化。

可以通過峰面積計算甲基化和非甲基化的比例;

方法優點:適用于大批量實驗;

方法局限性:比例的計算比較難,只適用于初步估計;

 

品名 貨號 特性 品牌 規格 價格
qPCR 甲基化檢測 A2010S0421 服務 BioTNT 樣·基因 詢價
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