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microRNA qPCR 實驗服務
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BioTNT 五年QPCR microRNA QPCR  檢測傾情服務!  優質服務品質回報社會!

BioTNT 生物技術服務部自從2005年成立以來,承接了超過200個QPCR microRNA 技術服務項目,積累了廣泛的QPCR 定量檢測的經驗。 
 
一、簡介: 關于microRNA
     MicroRNAs(miRNAs)是一種小的內源性非編碼RNA分子,大約由21-25個核苷酸組成。這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA,通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表達。成熟的microRNA 的形成包含多個步驟。首先,microRNA 基因被轉錄成命名為pri-microRNA 的初級轉錄物;動物pri-microRNA的第一次剪切位于細胞核內,產生大小為70個核苷酸左右并能形成莖-環結構的microRNA 前體,稱為pre-microRNA;第二次剪切位于細胞質中,pre-microRNA被剪切成21-25個核苷酸成熟的microRNA。
     MicroRNA 自從1993年首次被報道以來,現已經被發現了3000多種,存在于人類和所有的模式生物中。MicroRNA 通過與mRNA的3’ UTR 結合而介導翻譯水平的調控,也可通過與mRNA結合的互補程度決定microRNA將以何種機制發生作用;完全的互補引起與RNAi類似的作用,不完全互補則導致翻譯抑制作用。因此,研究microRNA對于深入探討生命現象的本質,解釋細胞行為和疾病發生機制,具有重要的理論意義;對于疾病的診斷、治療和預防具有潛在的實際應用價值。

    關于microRNA:

圖1,pre-microRNA 和 microRNA 示意圖
 
MicroRNA由于長度太短,一般難以檢測。
 
二、BioTNT miRNA qPCR Detection System 介紹
 
BioTNT 生物技術部推出了 miRNA qPCR Detection System , 是專門用于miRNA 定量檢測的系統。該系統包括:
·                 miRNA檢測試劑盒miRNA qRT-PCR Detection Kit:
  • 應用于miRNA的特異莖環逆轉錄系統、及其qPCR 反應特異miRNA的引物assay:
  • 特異性的莖環逆轉錄引物和qPCR檢測上下游引物。

      

特點:

  • 1.   應用莖環逆轉錄引物進行逆轉錄,可以區分成熟的microRNA和premicroRNA;
    2.   應用BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit,已經優化的適合特異莖環逆轉錄引物進行CDNA 合成的protocol,用于100個microRNA樣本的已知第一鏈CDNA合成;
    3.   BioTNT 經驗證的特異性莖環系統assay 可以提供您最方便的實驗方案;采用了100Tests的包裝,方便您的實驗;
     
    產品特征:
    ² 本方法可以采用經典的trizol法抽提得到的總RNA;
    ² 檢測的特異性:獨特的miRNA莖環逆轉錄引物的設計技術及其優化的反應體系避免了非特異性擴增、特別是Pre-miRNA的污染;
    ² 檢測分辨率高:該系統能分辨單堿基差異的miRNA;
    ² 一站式解決方案:BioTNT不僅提供檢測的試劑盒,還提供經驗證的人源、小鼠源、大鼠源的特異性microRNA assay;
    ² 檢測靈敏度高:可在低至pg級的總RNA中檢測到特異表達的miRNA;
    質量說明
  • BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit已包含有檢測所需要的所有試劑, 客戶僅需要提供RNA及BioTNT 特異性莖環系統assay即可進行miRNA檢測;
  • 我們提供的BioTNT 特異性莖環系統assay建議同BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit配套使用;
  • 我們承諾推出的每個BioTNT 特異性莖環系統assay都提供利用BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit進行驗證的報告,其報告內容包括驗證流程、引物相應擴增曲線、融解曲線、及其推薦的反應條件, 同時還提供陽性的cDNA驗證模板,客戶可以參考此條件進行檢測實驗。

 

三、BioTNT QPCR microRNA 樣本準備  
 
3.1 組織樣本準備
 
  注意:BioTNT QPCR microRNA 檢測的樣本取樣同Real time PCR的組織取樣與保存:
1、 取動物的組織,動作要求迅速,盡量避免樣本在環境中暴露太久;
2、 講樣本迅速放入無菌無酶的凍存管中,為保證質量,推薦選取Axygen,corning,nunc等國外品牌的凍存管;根據組織塊的大小,確定RNA 抽提方式;如果組織塊非常小,建議采用柱抽提試劑盒進行抽提( RNeasy Micro Kit(50) 74004 ),此時樣本中不要加入trizol;如果組織塊有100mg,可以采用trizol 法抽提總RNA的方式(RNA提取試劑盒(Trizol 法) A2010B0A01),進行樣本的保存,在樣本中加入1ml trizol 浸沒樣本;
3、 在凍存管上做好標記,盡量清晰易辨;在實驗記錄本上做好記錄,盡量詳細易查;
4、 將凍存管直接放入液氮中速凍;或加入1ml Trizol 到凍存管中,再放入液氮速凍;
5、 速凍2h 后,將凍存管從液氮轉至-80度冰箱,可以保存6個月左右;
 
BioTNT QPCR microRNA 的細胞取樣與保存
1、 懸浮細胞:500g 離心5min 取細胞,用PBS 清洗2-3遍,得細胞,并轉至放入凍存管中;
2、 根據細胞量進行后續抽提方式的選擇,如果細胞量大于5*10的5次方,可以采用trizol 方式進行總RNA 抽提,如果小于此量,建議采用Qiagen的柱式抽提( RNeasy Micro Kit(50) 74004 
);可以采用trizol 抽提的客戶,可在樣本中加入500ul Trizol 到凍存管中,吹打混勻(RNA提取試劑盒(Trizol 法) A2010B0A01);
3、 在凍存管上做好標記,盡量清晰易辨;在實驗記錄本上做好記錄,盡量詳細易查;
4、 將凍存管放入液氮速凍,2h 后,轉至-80度冰箱,可以保存6個月左右;
 
樣本運輸:干冰運輸
 
3.3  血清/血漿樣本準備:
建議采用血漿樣本,可以得到相對更好的實驗結果。
使用抗凝管采集全血,并盡快進行血漿分離:1000g離心10分鐘,分離血漿和細胞組分。(注意:血漿收集應使用抗凝管,抗凝劑可以用檸檬酸鈉或EDTA等,但一定不要使用肝素抗凝,因為肝素對后續實驗有較大影響。)將采集好的血漿轉移至單獨的凍存管,按照每400-500ul/管分裝好。
短期保存,可放入-20℃或-70℃冰箱。長期保存,請放入液氮。
 
3.4  全血樣本準備:
請按照實際使用的收集方法,如注射器收集或真空收集管等,參考相應的廠商提供產品說明進行操作。
采集好全血,將采集好的全血轉移至單獨的凍存管,按照每500ul/管分裝好。
短期保存,可放入-20℃或-70℃冰箱。長期保存,請放入液氮。
 
 
3.5  石蠟樣本準備:
石蠟切片,至少三片;或者提供石蠟塊,常溫保存。
 
 
、BioTNT QPCR microRNA 檢測使用的儀器
 
進行檢測使用的主要儀器為QPCR, BioTNT 使用life technology最新款的ViiA™ 7實時熒光定量PCR系統進行microRNA的QPCR 檢測。
 
ViiA™ 7實時熒光定量PCR系統在單一的高性能儀器上融合了您需要的所有實時熒光定量PCR特性,從而幫助您優化研究效率。ViiA™7系統具有簡單的工作流程、直觀的軟件、觸控屏界面以及使誤操作降至最少的單鍵實驗方案,可提供出眾的重復性和最小的孔間和儀器間差異。

產率
ViiA™ 7系統適用于中等至高通量實時熒光定量PCR,可提升您的實驗室效率。
快速的加熱塊更換——前開門設計使熱循環加熱??櫚母槐淶酶菀?,無需移動旁邊的設備,如機械臂或計算機
簡單的觸摸屏界面——儀器觸摸屏提供了一鍵式實驗方案,可快速簡單地完成各種應用Assay的設置
自動化兼容性——ViiA™ 7系統結合了Applied Biosystems® Twister® II 機器人,使您在自動化環境下實現效率最大化

整合
可與TaqMan® Array微流體芯片和 Applied Biosystems® TaqMan® Assay完全兼容:實時熒光定量PCR分析的金標準,具有高靈敏度、高特異性和寬動態范圍。
384 孔通量且無需機器輔助——采用TaqMan® Array微流體芯片,無需移液機器人或復雜的移液裝置;只需加入您的樣本和預混液,即可在ViiA™ 7系統上運行
與全套 TaqMan® Assay 兼容——ViiA™ 7系統已經過優化,可用于所有TaqMan® Assay(包括 MicroRNA、蛋白質、非編碼 RNA 和Pri-miRNA Assay),從而獲得清晰簡潔的數據

性能
ViiA™ 7系統具有下列特點:
OptiFlex® 系統——增強型熒光檢測,可實現準確且靈敏的數據分析
最大程度的多重分析能力——6 個可自由組合的激發和發射濾光片通道,可實現最多的染料組合和最大的多重反應能力
靈活的數據采集——多種升降溫方法檢測形式為升降溫階段的熒光數據采集提供了更多的靈活性
精確定量——在單色反應中可檢測出低至1.5倍的拷貝數差異

ViiA™ 7軟件具有:
直觀的界面和創新的設計
便捷的自動化操作
更強大的數據分析
與高通量完全兼容

可擴展的軟件構架
提供可選的附加性能,可升級至現有軟件。
遵循美國聯邦法規第21章第11節(21 CFR Part 11)——可選的SAE???,提供記錄安全、審計和電子簽名信息,從而實現全方位的數據可追溯性
高分辨率熔解曲線(HRM)——采用內置的MeltDoctor™ 實驗方案和校準,您可以縮短優化運行的時間,從而將更多的時間用于分析您的結果。通過方便的軟件設置即可根據需要設置基因型種類的數目。

 

儀器圖片:

 
 
 
五、BioTNT QPCR microRNA 檢測標準服務流程
 
BioTNT  microRNA 檢測技術服務標準流程:
1、 客戶提供樣本(組織,細胞或者RNA),請參照取樣與保存;
2、 客戶提供檢測指標;
3、與客戶協商內參的選?。ㄈ?,大鼠,小鼠均有兩種內參可以采用);
4、采用 BioTNT  PCRmiRNA qPCR Detection System ;
5、客戶樣本驗證進行抽提,特異性逆轉錄,QPCR 檢測,驗證系統是否好用;
6、 客戶的大批量樣本進行處理,抽提和實驗。
 
實驗對象為組織樣品,組織量不是很少的情況下,可以采用trizol 法進行抽提。取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿后抽提RNA。
實驗對象為細胞樣品,細胞數量不是很少的情況下,可以采用trizol 法進行抽提。每份樣品取1×106~1×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。
 
組織塊少或者細胞量小的時候,采用Qiagen 柱式抽提(RNeasy Micro Kit(50) 74004 )。費用為120元/個;
 
血液樣本,如血漿或者血清,采用Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit(50)217184 ,費用為140元/個;
石蠟樣本,采用miRNeasy FFPE kit(50)217504,費用為160元/個;
 
7、 RNA 特異性逆轉錄得到內參CDNA, 對樣本的質量進行驗證;
8、 大批量樣本real time PCR實驗;使用儀器為:ABI 公司的Vii7;
9、 靶基因表達水平結果分析,數據分析方法為:delta delta CT 法;也可以采用相對定量的標準曲線法;
10、 提供客戶實驗報告;包括方法,材料,設備,原始數據和計算數據的成套材料;
 
 
六、BioTNT real time PCR 檢測技術服務收費標準

實驗步驟
 
組織或細胞總RNA抽提   80元(trizol抽提microRNA,一個組織或細胞標本);
離心柱式抽提費用細胞/組織 120元/樣;
血清/血漿 140元/樣;
石蠟切片 160元/樣

 特異性逆轉錄+目的基因實時定量PCR    數據分析   雙重復數據120元(一個標本一個指標),三重復數據160元 (內參同樣按照目的基因收費)

引物等費用涵蓋在這里面;

 如需制備標準曲線,收取標準曲線制備費用200元/一個基因

 一次取樣,超過3個,免費;小于等于3個樣品, 上海市區收取20元/次的取樣費用;上海郊區,不上門取樣;

外地郵寄費用自理;

全套技術服務
您只需提供組織或細胞標本,我們為您完成RNA抽提,cDNA制備,實時定量PCR,標準曲線制備及數據分析的所有步驟。
 

【您只需提供】

組織
或,高濃度的Total RNA
◇microRNA 名稱
 
【我們向您提供】 
實驗材料、儀器、方法、步驟
供發表的引物序列、擴增曲線、熔解曲線
原始實驗數據和計算好的正式實驗數據
免費實驗培訓、技術支持
 
 

 

品名 貨號 特性 品牌 規格 價格
qPCR microRNA引物設計 A2010S0410 服務 BioTNT 基因 ¥500
qPCR microRNA基因檢測(單孔正式實驗) A2010S0417 服務 BioTNT 樣·基因 ¥40
qPCR microRNA基因檢測(雙復正式實驗) A2010S0418 服務 BioTNT 樣·基因 ¥80
qPCR microRNA基因檢測(三復正式實驗) A2010S0419 服務 BioTNT 樣·基因 ¥120
總共 4 條記錄 頁次: [1]   當前第 1 頁/共 1頁   每頁 25條 跳轉到 
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