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Western Blotting

 

Western blotting 實驗流程:

樣本處理→→蛋白定量→→樣本均一化→→制膠→→上樣→→電泳→→轉膜→→染膜→→膜的切割→→封閉→→雜交上一抗→→二抗→→顯色→→曝光→→數據處理→→膜的再生

 

熱銷產品

以下產品為了答謝各位老客戶,BioTNT優質免疫印跡試劑盒,特推出以下促銷活動:

 樣品處理:

裂解液和蛋白酶抑制劑:

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

單去污劑裂解液

A20120A0101

50ml

120

100

磷酸化蛋白和蛋白酶抑制劑cocktail

A20120A0105

1ml(100*)

450

300

單去污劑裂解液 可用于非磷酸化蛋白的裂解,成分為50mmol/L Tris?HCl pH8.0,150mmol/L NaCl,1SDS,1mmol/L PMSF;

 

蛋白酶抑制劑混合液含六種蛋白酶抑制劑,抑制范圍廣,可抑制氨肽酶以及天冬氨酸、半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶的活性。此抑制劑混合物適用于哺乳動物細胞及組織 抽提物。蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑混合液:主要成分由亮肽素,抑肽酶,胃蛋白酶抑制劑,EDTA-Na2,NaF氟化鈉,原礬酸鈉,甘油磷酸鈉,焦磷酸鈉等多種抑制劑,可以有效抑制磷酸化蛋白降解。

 

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

還原型SDS-page上樣緩沖液5X    

A20120A0210  

5ml

60

50

SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE Sample loading Buffer,5X)是一種經過改良的以溴酚藍為染料,5倍濃縮的蛋白上樣緩沖液,可用于常規的SDS-PAGE蛋白樣品的上樣。


 

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

預染蛋白分子量標準(10-170kDa

 

A20120A0803

100ul for 50

300

fermantas SM0672分裝

推薦:

銳利條帶,顏色穩定。
兩條參考條帶 – ~70 kDa的橙色條帶和~10 kDa綠色條帶。
即用型上樣 無需煮沸。
在凝聚中易于示蹤。
Western
轉移效果好。

 

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

BCA 蛋白定量測試盒  500微孔

A20120A0103

500微孔

340

300

 BCA蛋白質定量試劑使用BCAbicinchoninic acid),不受樣品中的去垢劑的影響,用于比色法檢測和定量總蛋白。此方法原理基于在堿性溶液中,蛋白質使Cu2+還原為Cu1+,使用一種含BCA 的試劑可以高靈敏度高特異性地顯色并檢測Cu1+,其反應產生的紫色產物為兩分子的BCA和一個Cu1+的鰲和物。這種水溶性復合物在562 nm處有很強的吸收值,且吸收值與加入的蛋白質濃度在較大范圍內(0 - 1,000 μg / ml)成正比。

 

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

A20120A0300

50T

280

進行50 塊膠,僅售280元。

BioTNT生產的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒提供了配制SDS-PAGE凝膠所需的各種試劑。用戶只需自備制膠器具和蒸餾水,即可配制PAGE膠(即聚丙烯酰胺凝膠)。

 

BioTNT 優質內參抗體,性價比高!

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

GAPDH 內參抗體

A20120A0701  

100ul

600

400

beta-actin 內參抗體

A20120A0702  

100ul

600

400

                                           

 36KD, GAPDH(人、小鼠、大鼠、兔、斑馬魚)100ul包裝,稀釋可達1:5000

  42KD, beta-actin人、小鼠、大鼠、斑馬魚)100ul包裝,稀釋比可達1:5000

一個包裝可進行250mini-blots實驗(2ml 孵育體積),可有效期長達兩年!

●  100 μl,250個mini-blots實驗(2ml 孵育體積) 僅售400元
●   條帶清晰,高效敏感;

●   稀釋比例可達5000;

●   有效期達2年;

 

 

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

Western 4孔孵育槽(可節省抗體用量)  

A20120A0609  

4/

260

200

推薦: 可節省抗體用量,孵育體積可以減小到2ml,有效節省一抗、內參抗體、二抗等抗體。

 

品名

貨號

規格

價格

優惠促銷價

ECL western blot substrate(超敏)    

A20120A0501  

100ml

750

550

●  僅售 550/100ml。

●  每次用量2ml,每張膜成本低于15元,一個試劑盒可以進行50次實驗。

●  高靈敏度,高信噪比,特別適用于檢測低豐度的蛋白質。

●  節省抗體及樣品用量。

 

 

BioTNT western blotting(免疫印跡)試劑按照實驗流程進行排列:

 

實驗流程 品名 貨號 規格 價格
樣本處理 單去污劑裂解液 A20120A0101 50ml ¥120
磷酸化蛋白單去污劑裂解液 A20120A0102 50ml ¥350
蛋白酶抑制劑cocktail A20120A0104 1ml(100*) ¥350
磷酸化蛋白和蛋白酶抑制劑cocktail A20120A0105 1ml(100*) ¥350
蛋白定量 BCA 蛋白定量測試盒  500微孔 1-PC0020 500微孔 ¥350
制膠(小量推薦) SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 A20120A0300 50T ¥350
制膠(超過50張膜--大量推薦) Tween   20  1-T8220-100ml 100ml ¥40
吐溫-20 1-T8220-500ml 500ml ¥100
甲叉雙丙烯酰胺(Bic)N,N-Methylenebisacrylamide   Bis-acrylamide,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺 2-M6024-25G 25g(99%電泳級) ¥79
甲叉雙丙烯酰胺(Bic)N,N-Methylenebisacrylamide   Bis-acrylamide,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺 2-M6024-100g 100g(99%電泳級) ¥232
甲叉雙丙烯酰胺(Bic)N,N-Methylenebisacrylamide   Bis-acrylamide,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺 2-M6024-250g 250g(99%電泳級) ¥462
Acrylamide(丙烯酰胺) 2-A6299-25g 25g(99%電泳級) ¥46
Acrylamide(丙烯酰胺) 2-A6299-500g 500g(99%電泳級) ¥196
Acrylamide(丙烯酰胺) 2-A6299-5kg 5kg(99%電泳級) ¥686
TEMED 四甲基乙二胺  2-N818999-5ml 5ml ¥26
TEMED 四甲基乙二胺  2-N818999-25ml 25ml ¥40
Tris?HCl    1.5mol/L(pH8.8) A20120A0203 100ml ¥60
Tris?HCl    0.5mol/L(pH6.8) A20120A0204 100ml ¥60
上樣 還原型SDS-page上樣緩沖液5X   A20120A0210 5ml ¥60
蛋白分子量Marker 預染蛋白分子量標準(10-170kDa) 3-26617 250ul   for 125 ¥350
電泳和轉膜(小量推薦) 電泳緩沖液 A20120A0209 可配制 10L ¥120
Western 轉膜液 A20120A0208 可配制 10L ¥120
電泳和轉膜(大量推薦) SDS 1-S8010-100g 100g ¥80
SDS 1-S8010-500g 500g ¥240
Tris 三氨基甲烷 1-T8060-100g 100g ¥80
Tris 三氨基甲烷 1-T8060-500g 500g ¥180
Tris 三氨基甲烷 1-T8060-1kg 1kg ¥320
Tris 三氨基甲烷 1-T8060-5kg 5kg ¥1,500
甘氨酸  1-G8200-100g 100g ¥30
甘氨酸  1-G8200-500g 500g ¥80
甘氨酸  1-G8200-1000g 1000g ¥140
甘氨酸  1-G8200-5kg 5kg ¥600
膜,濾紙 PVDF膜0.45um    規格:15x13.5cm 1-YA1701-13.25*15 ¥100
PVDF膜0.22um    規格:15x13.5cm 1-YA1700-13.25*15 ¥110
0.45um PVDF 整卷 millipore-IPVH00010 ¥2,400
0.45um NC 整卷 millipore-HATF00010 ¥2,400
0.22um PVDF膜整卷 millipore-ISEQ00010 ¥2,800
3MM濾紙 Whatman 3030-704-27cm×1m 27cm×1m ¥80
3MM濾紙 Whatman 3030-861-100張/盒 100張/盒 ¥760
大張濾紙 1-YA0166-60*60cm 60*60cm ¥6
染膜 10X麗春紅染液(染膜專用)    A20120A0207 50ml ¥80
TBS緩沖液(濃縮液) A20120A0211 可配制2L ¥95
TBST緩沖液(濃縮液) A20120A0212 可配制2L ¥95
封閉 DifcoTM   Skim Milk 脫脂奶粉  D8340-10g 10g ¥50
DifcoTM Skim Milk 脫脂奶粉  D8340-100g 100g ¥160
DifcoTM Skim Milk 脫脂奶粉  D8340-500g 500g ¥480
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ A8020-5g 5g ¥50
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ A8020-10g 10g ¥95
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ A8020-25g 25g ¥220
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ A8020-50g 50g ¥400
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ A8020-100g 100g ¥600
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ A8020-500g 500g ¥2,800
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ A8020-5kg 5kg ¥25,000
雜交 Western   4孔孵育槽(Nunc可節省抗體用量) A20120A0609 4個/組 ¥120
Western 5孔孵育槽(國產) 5 ¥10
一抗二抗稀釋液 A20120A0214 100ml ¥110
抗體稀釋液(普通) A1800-10ml 10ml ¥30
抗體稀釋液(普通) A1800-50ml 50ml ¥70
抗體稀釋液(普通) A1800-100ml 100ml ¥100
HRP標記抗體稀釋液 EL-CPV05-10ml 10ml ¥50
HRP標記抗體稀釋液 EL-CPV05 50ml ¥240
HRP標記抗體稀釋液 EL-CPV05-100ml 100ml ¥400
熒光抗體稀釋液 A1840-10ml 10ml ¥30
熒光抗體稀釋液 A1840-50ml 50ml ¥70
熒光抗體稀釋液 A1840-100ml 100ml ¥100
特異性一抗
內參抗體 GAPDH 內參抗體 A20120A0701 100ul ¥500
beta-actin 內參抗體 A20120A0702 100ul ¥500
二抗 Jackson Goat   Anti-Mouse   IgG(H+L) HRP A20120A0703 100ul ¥258
Jackson Goat   Anti-Rabbit  IgG(H+L) HRP A20120A0704 100ul ¥258
Jackson   Rabbit Anti-Goat  IgG(H+L) HRP A20120A0705 100ul ¥298
Anti-rat IgG(H+L) HRP 1-SE132-0.1ml 100ul ¥150
羊駝兔抗AlexaFluor 488標記 srbAF488-1-10-b 10ul ¥820
羊駝兔抗AlexaFluor 568標記 srbAF568-1-10 10ul ¥1,480
羊駝兔抗AlexaFluor 647標記 srbAF647-1-10 10ul ¥1,480
羊駝抗小鼠IgG1 Fc特異AlexaFluor 647標記 sms1AF647-1-10 10ul ¥1,480
羊駝抗小鼠IgG2b Fc特異AlexaFluor 647標記 sms2bAF647-1-10 10ul ¥1,480
羊駝抗小鼠IgG3 Fc特異AlexaFluor 647標記 sms3AF647-1-10 10ul ¥1,480
羊駝兔抗AlexaFluor 488標記 srbAF488-1-100 100ul ¥5,340
羊駝兔抗AlexaFluor 568標記 srbAF568-1-100 100ul ¥5,340
羊駝兔抗AlexaFluor 647標記 srbAF647-1-100 100ul ¥5,340
羊駝抗小鼠IgG1 Fc特異AlexaFluor 647標記 sms1AF647-1-100 100ul ¥5,340
羊駝抗小鼠IgG2b Fc特異AlexaFluor 647標記 sms2bAF647-1-100 100ul ¥5,340
羊駝抗小鼠IgG3 Fc特異AlexaFluor 647標記 sms3AF647-1-100 100ul ¥5,340
顯色部分 ECL   western blot substrate  1-PE0010-50ml*2 50ml*2 ¥600
Searchlight Ultra-Sensitive Chemiluminescent   HRP Membrane/Blotting ECLSubstrate 3-RB-SRCHLGT-1L 1L ¥3,622
Lumigen ECL Ultra (高敏免疫印跡HRP發光底物) lumigen-TMA-100 100ml ¥2,666
曝光 X-OMAT   BT 醫用X射線膠片,12.7*17.8cm 100張/盒 carestream#6535876 5*7,100張/盒 ¥200
X光片夾(暗盒) 1-YA0860-5*7 5*7/ ¥280
X光片夾(暗盒) 1-YA0861-8*10 8*10/ ¥340
顯影粉 1-YA0380 1L ¥20
定影粉   1-YA0370 1L ¥20
其他自配試劑 10% SDS A20120A0201 100ml ¥100
Tris?HCl    1.0mol/L(pH8.0) A20120A0202 100ml ¥60
Tris?HCl    1 mol/ L(pH7.5) A20120A0205 100ml ¥60
考馬斯亮藍G- 250(蛋白定量用) 1-PC0015-100ml 100ml ¥120
考馬斯亮藍G- 250(蛋白定量用) 1-PC0015-500ml 500ml ¥480



 

 


品名 貨號 特性 品牌 規格 價格
特異性一抗 BioTNT 詢價
詢價
甘氨酸? 1-G8200-1000g BioTNT 1000g ¥180
¥140
甘氨酸? 1-G8200-100g BioTNT 100g ¥40
¥30
甘氨酸? 1-G8200-500g BioTNT 500g ¥100
¥80
甘氨酸? 1-G8200-5kg BioTNT 5kg ¥780
¥600
5×考馬斯亮藍G- 250(蛋白定量用) 1-PC0015-100ml BioTNT 100ml ¥160
¥120
5×考馬斯亮藍G- 250(蛋白定量用) 1-PC0015-500ml BioTNT 500ml ¥620
¥480
BCA?蛋白定量測試盒? 500微孔 1-PC0020 BioTNT 500微孔 ¥460
¥350
ECL western blot substrate? 1-PE0010-50ml*2 BioTNT 50ml*2 ¥780
¥600
SDS 1-S8010-100g BioTNT 100g ¥100
¥80
SDS 1-S8010-500g BioTNT 500g ¥310
¥240
Anti-rat IgG(H+L) HRP 1-SE132-0.1ml BioTNT 100ul ¥200
¥150
Tris?三氨基甲烷 1-T8060-100g BioTNT 100g ¥100
¥80
Tris?三氨基甲烷 1-T8060-1kg BioTNT 1kg ¥420
¥320
Tris?三氨基甲烷 1-T8060-500g BioTNT 500g ¥230
¥180
Tris?三氨基甲烷 1-T8060-5kg BioTNT 5kg ¥1950
¥1500
Tween 20? 1-T8220-100ml BioTNT 100ml ¥50
¥40
吐溫-20 1-T8220-500ml BioTNT 500ml ¥130
¥100
大張濾紙 1-YA0166-60*60cm BioTNT 60*60cm ¥10
¥6
定影粉?? 1-YA0370 BioTNT 1L ¥30
¥20
顯影粉 1-YA0380 BioTNT 1L ¥30
¥20
X光片夾(暗盒) 1-YA0860-5*7 BioTNT 5*7/個 ¥360
¥280
X光片夾(暗盒) 1-YA0861-8*10 BioTNT 8*10/個 ¥440
¥340
PVDF膜0.22um????規格:15x13.5cm 1-YA1700-13.25*15 BioTNT ¥140
¥110
PVDF膜0.45um????規格:15x13.5cm 1-YA1701-13.25*15 BioTNT ¥130
¥100
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  • western blot 原理

  • western blot 技術服務流程

  • western blot 樣本準備


western blot 原理:

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting),是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析。結合化學發光檢測,可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

 

Biotnt  Western blot 實驗流程:

蛋白制備及初定量 ---蛋白變性 -------特異蛋白分離----固相載體轉移 -------免疫反應 --------發光底物酶促反應----------檢測

 

BioTNT  western blot技術優勢:

專業技術優勢


多重均一化控制


通過對樣本測量,蛋白定量,內參控制等手段嚴格均一化各樣本蛋白量,真實呈現蛋白表達差異性。完善產品鏈條我公司有關于wb試驗完整的產品線,從相關試劑耗材到試劑盒,涵蓋wb全部試驗用品,滿足您wb試驗各方面需要。

完善western blot產品線:

我公司有關于wb試驗完整的產品線,從相關試劑耗材到試劑盒,涵蓋wb全部試驗用品,滿足您wb試驗各方面需要。

提供給您實驗室全套的western blot 解決方案;

客戶western blot 樣本要求:


您只需要提供

1.樣本要求:盡可能新鮮;

2.樣本量:組織樣本,質量大于100mg;細胞樣本,細胞數大于1×106;

3.您可自備一抗,也可讓我公司代買,為保證質量,抗體最好為進口單克隆或多克隆抗體;

4.服務時限和內容:收到樣本之日起20-30個工作日內提交實驗結果,具體包括實驗方法、步驟、所用試劑、儀器、膠片,圖片及相關分析數據等;

5.報告送達:實驗結果將以電子或書面形式提交給您。

 

 

溫馨小貼士

樣本制備及注意事項:

懸浮細胞: 取大約 1×107個細胞,低速離心收集,棄去培養液,加入1ml PBS懸浮細胞,轉入小離心管中,低速離心沉淀細胞,棄去PBS,放入-70℃ 冰箱保存。干冰運輸。

貼壁細胞:取大約1×107個貼壁細胞,胰酶消化后加入PBS懸浮細胞,低速離心收集,棄去液體,加入 1 ml PBS懸浮細胞,轉入小離心管中,低速離心沉淀細胞,棄去PBS,放入-70℃冰箱保存。干冰運輸。

組織:采集新鮮組織(注意:生物體死亡后10分鐘內取材料并保存好),組織塊以PBS或生理鹽水清洗干凈,切為小塊,放入液氮或-70℃冰箱中保存,干冰運輸。

 


Introduction

 

本實驗是檢測蛋白的定性及半定量的技術方法;

實驗步驟概述:

1.       確認目的蛋白信息,訂購或提供相應一抗;

2.       存于液氮中的組織或細胞用蛋白裂解液(含PMSF,若有磷酸化蛋白,則同時含有磷酸酶抑制劑)進行蛋白的提??;

3.       提出的蛋白用BCA系統進行蛋白初定量;

4.       Western預實驗(一個靶標蛋白一張膜預跑);

5.       Western正式實驗(優化并固定實驗條件,完成所有樣本與靶標蛋白);

6.       判斷實驗結果,灰度值讀取,進行半定量計算;

 

Antibody

蛋白信息是從NCBI上面查得;

一抗信息根據相應公司貨號查詢并下載的protocol;

二抗信息如下:Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP (jackson)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP (HRP) (jackson)、Rabbit Anti-Goat IgG(H+L) HRP (jackson );

常見的抗體公司如下:abcam、Epitomics、Cell signaling、Dako、Sigma、BD、R&D system、Millipore、jackson;

 

Sample

Ø  樣本采集和保存:

盡量新鮮采集樣本,及時添加裂解液裂解樣本,冰上裂解,樣本熱變性并加入loading buffer待測,保存溫度越低越好。

Ø  從組織或細胞內提取裂解物:

相對于普通裂解液,利用變性程度更強的RIPA緩沖液會更徹底和穩定的裂解組織;超聲加上化學裂解能得到非常好的效果;對于組織樣品,建議使用勻漿的步驟。

Ø  磷酸化蛋白檢測:

使用磷酸化單去污裂解液(RIPA+磷酸酶抑制劑),降低磷酸化蛋白降解風險。

 

Product

樣本制備

品名

貨號

規格

價格

單去污劑裂解液RIPA

A20120A0101

50ml

RMB 120

Tris·HCl 1.0mol/LpH8.0

A20120A0202

100ml

RMB 60

磷酸化蛋白單去污劑裂解液

A20120A0102

50ml

RMB 300

cocktail蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑混合液

A20120A0102b

 

RMB 450

PMSF

A20120A0901

1g

RMB 50

還原型5X SDS上樣緩沖液

A20120A0210

10ml

RMB 40

 

電泳轉膜

品名

貨號

規格

價格

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

A20120A0300

 

RMB 280

Tris·HCl 0.5mol/LpH6.8

A20120A0204

100ml

RMB 60

Tris·HCl 1.5mol/LpH8.8

A20120A0203

100ml

RMB 60

電泳緩沖液

A20120A0209

可配制10L

RMB 120

Western 轉膜液

A20120A0208

可配制 4.8L

RMB 120

預染蛋白分子量標準(10-170kDafermantas

A20120A0803

100ul for 50

RMB 300

3MM濾紙

A20120A0604

RMB 70

NC

A20120A0603

15x20cm/

RMB 60

 

孵育曝光

品名

貨號

規格

價格

DifcoTM Skim Milk 脫脂奶粉

A20120A0402

10g

RMB 40

10X麗春紅染液(染膜專用)

A20120A0207

50ml

詢價

beta-actin 內參抗體

A20120A0702

100ul

RMB 600

GAPDH 內參抗體

A20120A0701

100ul

RMB 600

TBST緩沖液(濃縮液)

A20120A0212

可配制2L

RMB 95

TBS緩沖液(濃縮液)

A20120A0211

可配制2L

RMB 95

Tris·HCl 1 mol/ LpH7.5

A20120A0205

100ml

RMB 60

洗脫抗體緩沖液

A20120A0213

100ml

RMB 95

 

 

Material & Methods

 

實驗所用試劑:

1.      PMSF、Tween20、丙稀酰胺、氟化鈉、過硫酸胺、甲叉雙丙稀酰胺、偏礬酸鈉、HCl、NaCl、異丙醇、DTT、TEMED、β-巰基乙醇、甘氨酸、甘油、磺基水楊酸、甲醇、麗春紅、三氯乙酸、溴酚藍,國藥;

2.      SDS、Tris,Sigma;

3.      脫脂奶粉,Difco;

4.      BSA,Roche;

5.      ECL化學發光試劑,promage;

6.      定影粉、顯影粉,柯達;

 

實驗相關儀器:

1.      微型離心機,GyroSpin,GYROZEN;

2.      電熱恒溫水槽,DK-420,上海精宏實驗設備有限公司;

3.      電子天平,ES120,D&T;

4.      12孔高速微量離心機,MicroSmart,北京昊諾斯科技有限公司

5.      電泳儀電源,DYY-7C,北京市六一儀器廠;

6.      電泳儀、轉膜儀,DYCZ-40D,北京市六一儀器廠;

7.      X射線攝影暗匣,AX-II,廣東粵華醫療器械廠有限公司;

8.      水平搖床,TS-1,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;

9.      旋渦混合器,GL-88B,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;

10.   迷你水平搖床,MH-1,海門市其林貝爾儀器制造有限公司

11.   恒溫金屬浴,HB-100,杭州博日科技有限公司;

12.   酶標儀,DNM-9602,北京普朗新科技有限公司;

13.   離心機,TDL-80-2B,飛鴿牌;

14.   超細勻漿器,F6/10-6G,FLUKO(上海)流體機械制造有限公司;

15.   移液器,10ul/200ul/1000ul,Dragonlab;

 

實驗相關耗材:

1.      1.5ml無色離心管,MCT-150-C,Axygen;

2.      200ul 黃吸頭,T-200-Y,Axygen;

3.      0.5-10ul 透明Gilson吸頭,Axygen;

4.      0.6ml無色離心管,MCT-060-C,Axygen;

5.      96孔酶標板,Nunc;

6.      濾紙,上海實生細胞生物技術有限公司

7.      0.45um NC膜,Millipore,Millipore

8.      抗體4孔孵育槽,Nunc;

 

實驗步驟

第一步、樣本預處理:

1)單層貼壁細胞總蛋白提?。?/span>

1.      倒掉培養基,用4℃預冷1*PBS3次,注意不要用胰酶消化,也不要把細胞吹下,冰上操作。

2.      10^6個細胞加200ul單去污劑裂解液(RIPA)(一般6孔板長滿1孔細胞,每孔加200ul裂解液,覆蓋整個細胞底面即可),用槍頭把細胞刮下來,邊刮邊用移液器吸取裂解液將細胞吹下。

3.      細胞吹下后冰上放置30min裂解,用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中。

4.      收集的細胞樣本-20℃凍融一次。

5.      4 12000rpm離心5min。離心完后取上清-80℃保存待用。

2)懸浮細胞總蛋白提?。?/span>

1.      將培養液直接倒入1.5ml離心管,4 1500rpm離心5min,棄上清,如果體積超過1.5ml,可將剩余培養液倒入相對應的離心管,重復離心棄上清的步驟,直到所有細胞被離心收集。

2.      4℃預冷1*PBS重懸細胞,4 1500rpm離心5min,棄上清,冰上操作。

3.      10^6個細胞加200ul單去污劑裂解液(RIPA),用移液器吹打混勻,冰上裂解30min。

4.      收集的細胞樣本-20℃凍融一次。

5.      4 12000rpm離心5min。離心完后取上清-80℃保存待用。

3)組織總蛋白提?。?/span>

1.      根據組織塊大小,基本按照重量體積比1:5加入單去污劑裂解液(RIPA)。

2.      根據組織不同,采取的前期預處理方式不同,如肝臟這類比較塊大但不粘稠的組織,可以先用剪刀剪碎,然后用電動勻漿機勻漿;眼角膜之類的比較小,不易用勻漿機勻碎,可用研磨棒研磨;腦干一類比較好處理,可直接用勻漿機勻漿;肌肉或其他粘膜或上皮組織,需要先剪碎,再用研磨棒研磨。(所有處理需在冰上操作)。

3.      冰上放置裂解30min后,用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中。

4.      4 12000rpm離心10min。離心完后取上清-80℃保存待用。

4)上樣樣本制備:

1.      使用BCA系統進行蛋白初定量(參照BCA蛋白定量試劑盒說明書);

2.      利用BCA蛋白定量結果,均一化所有樣本總蛋白濃度,即向濃度較高樣本中加入適量單去污劑裂解液(RIPA);

3.      每管樣本中加入等量上樣緩沖液(loading buffer);

4.      將樣本放入恒溫金屬浴95 15mins,取出即可上樣電泳,或-80℃保存待用;

注意:

1.      Western實驗需要足夠多的蛋白量以保證實驗結果的質量,樣本量需細胞多于10^6個,組織濕重大于50mg,勻漿液體積大于100ul且總蛋白濃度大于0.5mg/ml;

2.      高脂肪或糖類組織,組織勻漿或液氮研磨後須4 12000rpm 10min去掉不溶物,再進行下面操作,若頂層有脂肪物,則也須去掉;

3.      Western的蛋白樣本制備后,越早進行實驗,效果越好,保存時間過長會增加蛋白降解風險;

4.      磷酸化蛋白有豐度低、易降解的特點,做Western實驗必須在RIPA中預先加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑,以保證實驗質量。

 

第二步、電泳制膜:

1.      按目的蛋白大小制取1.0mm分離、濃縮膠,分離膠的配制:10%;

2.      將膠浸沒于電泳緩沖液中,向泳道中注入10μg 預處理蛋白樣本;

3.      濃縮膠電泳條件80V 30mins,分離膠電泳條件120V 60mins;

4.      將電泳得到的帶有蛋白的分離膠按以下順序疊放:海綿墊、3層濾紙、分離膠、NC膜、3層濾紙、海綿墊,將膠朝向負極、轉膜裝置浸沒于轉膜緩沖液中;

5.      小分子蛋白(小于90kDa)轉膜條件為4 60V 1.5h,大分子蛋白 (大于90kDa)轉膜條件為4 120V 2h;

6.      轉膜后,將轉膜制得的承載膜先置于TBST中浸潤,在麗春紅中染色,驗證轉膜成功后用TBST將麗春紅洗脫,進入孵育步驟;

注意:

1.      本實驗中使用的承載膜為硝酸纖維素(NC)膜,轉膜方式為濕轉。

2.      如需測的蛋白分子量大小差距較大,可將膜根據marker剪開,孵育不同的抗體。

3.      在上樣時,為了保證電泳質量,最兩邊的泳道以及未上樣的泳道會上有loading buffer?;?。

來自"//www.transhold.org/wiki/RT-PCR_%E4%B8%A4%E6%AD%A5%E6%B3%95%E7%9A%84CDNA%E5%90%88%E6%88%90%E5%B8%B8%E7%94%A8%E8%AF%95%E5%89%82%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E%E2%80%94%E2%80%94promega_MMLV"

 

第三步、封閉孵育曝光、抗體洗脫;

1.      將載有蛋白的承載膜整張浸沒于5%脫脂牛奶中,室溫搖晃1h。

2.      TBST稀釋一抗,將膜浸沒于稀釋過的一抗工作液(總體積為2ml)中,4℃孵育過夜或者室溫孵育1.5h。

3.      TBST在搖床上室溫清洗已經孵育好一抗的膜,10min*3次。

4.      TBST稀釋二抗,將膜浸沒于稀釋過的二抗工作液(總體積為2ml)中,室溫孵育1 h。

5.      TBST在搖床上室溫清洗已經孵育好二抗的膜,10min*3次。

6.      將膜從TBST中取出,放在平整的位置,向膜上滴加ECL發光液,將膜移至曝光袋中(防止ECL直接接觸X光片)。

7.      在暗室中,將曝光袋放入X射線攝影暗匣內,再放上合適大小的X光片,關上曝光匣開始曝光。曝光結束后,取出X光片,在顯影液中浸泡3分鐘,稍加瀝干,置于定影液中放置3分鐘。將曝光完成的X光片在水下沖洗,至無定影液殘留,此時X光片上相應位置的黑色條帶即為最終結果。

8.      經過抗體孵育、曝光后的膜可用抗體洗脫液洗脫抗體。將膜放入抗體洗脫液,在50℃水浴中,手動攪拌5分鐘,靜置10分鐘,重復3次。

9.      抗體洗脫后的膜需從封閉重新開始,孵育一抗、二抗、曝光。

注意:

1.      實驗中本公司提供內參β-actin、GPADH一抗以及抗兔、小鼠、山羊二抗抗體,目的蛋白抗體或特殊種屬二抗由客戶提供。

2.      WB最終實驗結果與一抗質量及樣本有密切關系,實驗中技術員會根據曝光結果調整一抗稀釋比及上樣量,如最終結果不佳是由客戶提供的一抗質量或樣本較差所致,本公司概不負責。

3.      實驗中的一般曝光條件為1min、5mins、1h,取效果最佳的一張;根據曝光的結果,此條件可適當調整。

4.      抗體洗脫為正常實驗步驟,可能會洗去部分蛋白,但在多數情況下并不影響實驗結果,但不建議多次反復進行抗體洗脫,以免影響后續實驗質量。

5.      TBST洗膜的步驟可根據具體情況適當調整洗膜時間與次數。

 

Discussion

 

一、預處理前的準備工作:

蛋白酶非常穩定,是導致蛋白降解最主要的物質。它在一些極端的條件可以暫時失活,但限制因素去除后又迅速復性。用常規的高溫高壓蒸汽滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使蛋白酶完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上,因此,在與蛋白制備有關的分子生物學實驗時,必須戴手套。

蛋白酶的又一污染源是取液器,根據取液器制造商的要求對取液器進行處理。

處理樣本時盡可能使用無菌,一次性塑料制品,如果沒有開封使用過,通常沒有必要再次處理。

二、電泳制膜說明:

將處理過的樣本蛋白在PAGE膠中電泳,通過分離膠的分子篩作用得到不同分子量大小的蛋白,并將電泳得到的蛋白原位轉移至承載膜上。

三、封閉孵育曝光、抗體洗脫說明:

5%脫脂牛奶將承載膜上多余的蛋白承載位點封閉,浸潤于稀釋過的一抗中,通過抗體和抗原的特異性結合,使一抗與樣本蛋白中的相應抗原結合,洗去多余一抗,再將膜浸潤與稀釋過的二抗中,使二抗(含有HRP)與一抗(此時為抗原)結合,洗去多余二抗,在膜上滴加適量ECL發光液,ECL發光液在HRP的作用下發出熒光,可被X光片吸收成像。曝光成像后X光片上的相應位置的黑色條帶即為最后結果。在一個蛋白完成后,可通過抗體洗脫液將結合在蛋白上的一抗、二抗洗去,再次孵育一個抗體。

四、數據分析部分:

最后曝光所得的X光片會經過掃描機掃描,由技術員截圖,并經過圖像軟件得到去除背景的灰度圖像,由電腦計算目的條帶的陰影面積得到數值,并由技術員做出數據報告。

 

1.檢查儀器及試劑

    檢查各儀器是否完好可用,各試劑是否在使用期限內,各耗材是否準備充分。

 

 

2. 樣本前處理及蛋白定量

   將保存好的樣本(注意避免反復凍融)取出,用剪刀和鑷子將其剪成實驗所需大小,置于離心管中,在管壁上標識樣本名稱,注意取不同樣本時的取樣工具要在PBS中清洗,避免交叉污染,在天平上稱量樣品重量,記錄,根據所稱重量加入5倍體積的單去污裂解液,用電動勻漿機進行勻漿,在勻漿不同樣本時要在PBS中清洗,避免交叉污染,勻漿后在離心機中12000轉離心15分鐘,取上清液測定蛋白濃度,(注意要盡快測蛋白濃度防止降解),測定用BCA試劑盒,做法依說明書所示。


3. 蛋白變性

將測好蛋白濃度的樣本進行均一化處理,按照測量蛋白濃度的結果,以樣本中最小蛋白含量為參照值,拉平所有樣本蛋白濃度,計算在16ul體系下需要加的樣本和補足的緩沖液的體積數,(若需要多次試驗則準備160ul體系的各體積數),置于90℃金屬浴中15分鐘。變性結束后,及時保存好樣本,供后續試驗使用。


4. 電泳

   4.1配膠

      將配膠用的玻璃板置于有洗滌劑的清水中(每周一換)用棉條輕輕擦拭(不可用布,防止劃傷玻璃),洗好后用清水沖干凈,標準是在玻璃板面上有凝聚的水珠而非大灘的水漬,在操作臺上鋪一層紙巾,將兩塊玻璃板放在紙巾上,互相結合面朝上,用吹風機吹干板上水珠,若有殘留,用紙巾將水珠點干,避免大面積擦拭劃傷玻璃。

       手持已經干燥的玻璃板,注意手持玻璃板邊緣,將其重合好后,置于制膠器中,用楔子固定,注意觀察兩玻璃底面與制膠器底部是否水平,縫合良好,將做好的制膠器置于制膠架上,(制膠架擦拭干凈),固定時將兩側的固定軸同時往里擠壓,然后雙手同時順時針轉動至所需標的角度上(1.0mm的膠轉至1.0mm刻度以此類推),聽到雙手轉至咔的一聲,固定結束。

       配置分離膠,按照試劑配置表,準備好相應的試劑,注意試劑的保存條件,配膠時要迅速,防止時間過長凝膠,若溫度過低導致試劑沉淀,凝結,則需在37℃水浴中將其混合均勻,配好后,用900ul的槍在一面玻璃板上加5槍,注意加的時候要緩慢加,避免漏膠,避免混入氣泡,然后用槍在板面各處滴加水滴壓膠,至與板面水平,制好后等待20分鐘以便凝膠,若溫度過低,需要置于室溫20℃環境中凝膠,或者延長凝膠時間。

       將板面的水層傾倒,用濾紙吸干殘留的水滴,注意不要和分離膠接觸,以免發生粘連。配置濃縮膠要求同上,在配好后迅速插入上樣梳,注意插好后不要太用力,等待凝膠時間和溫度過低時處理方式亦同上。凝膠后一定要在制膠槽中充入電泳液再拔梳子,否則拔得時候上樣孔會扭曲,拔梳子時,雙手同時捏住梳子的兩端,同時輕輕往上拔,用力要均勻一致,避免產生氣泡,若拔的過程中,凝膠不好,可能是由于配濃縮膠所用AP或TEMD不準,需要重配,這一步一定很謹慎,否則做不好會導致重來浪費時間,后續的操作都要依次后推。

 

  4.2上樣 

      事先將每塊膠的泳道上樣的排版排好,一般一塊膠上8個樣本,不同客戶的樣本用loading隔開,若排不滿15個泳道,其余空的泳道用loading隔開,一般樣本上16ul體系,loading上4ul,marker上3ul體系,加樣的時候,槍頭注意不要插入上樣槽很深,注意加樣不要溢出。若上4塊膠或更多時,要注意一定要等所有的膠全部制好才能上樣,否則溴酚藍在緩沖液中時間過長會導致溢出。

電泳,在電泳槽中充滿電泳緩沖液,電泳液不要過滿,注意接頭處要保持干燥避免短路,電泳儀調至80v跑30-45分鐘,待在濃縮膠中將蛋白拉到同一水平線上,轉到120v,共跑一個半小時。注意要把marker分子量最小的蛋白跑出來。有的電泳中蛋白阻力比較大,一個半小時可能還沒有把分子量最小的蛋白跑出來,要延長電泳時間,直到跑出。


5. 轉膜

      準備一個水槽,充入轉膜緩沖液,將電泳結束后的電泳裝置拆開,把玻璃板取出在清水下沖一下,雙手抵住玻璃板將結合部位撬開,注意一定要動作柔和,防止膠碎,用小鏟子將膠和玻璃貼合面輕輕劃痕,把濃縮膠的部分棄掉,分離膠的部分用鏟子輕輕鏟出放在有轉膜緩沖液的水槽中,取三張濾紙重疊好,浸入轉膜緩沖液,取一張轉膜的nc膜,注意用鑷子取夾,避免接觸到nc膜表面,浸入轉膜緩沖液中,將膠按照上樣的順序平置于掌心中,上面墊一層nc膜,注意覆蓋完全,再在上面一層墊三層濾紙,取一層浸了轉膜緩沖液的棉墊,在膠的下層同樣放置浸了轉膜緩沖液的濾紙和棉墊,將“整個三明治 ”放在水槽中,用鏟子水平趕走氣泡,注意要記住膠在上面還是膜在上面,將膠的一面放在轉膜夾的黑色一面,插好后充入轉膜緩沖液,轉膜電壓60v,在4℃下轉膜一個半小時。


6. 染膜

      將轉膜結束的裝置拆開,用鑷子取出nc膜,放入TBST中,其余棉墊清洗后回收使用,濾紙以及膠棄掉,膠有毒注意妥善處理。按照麗春紅溶液:雙蒸水1:10配置染膜溶液,混勻。用鑷子夾取nc膜放入染膜溶液中浸沒,三分鐘后放入清水中清洗,觀察染膜結果,目的蛋白是否在準確的位置上。用剪刀剪下目的蛋白區域的膜,注意要用鑷子避免接觸到蛋白,剪膜的時候注意避免接觸到目的蛋白,在膜的邊緣無蛋白區標識可識別的標志。


7. 封閉

  脫脂牛奶0.5g,加到TBST 50ml中,現配現用,將剪好的nc膜放在封閉液中,注意不要將膜層疊在一起,在脫色搖床上以一定的速率進行封閉一個小時。


8. 一抗

      將一抗按照說明書上的稀釋比進行稀釋,若預實驗效果不好,進行梯度稀釋,注意樣本和抗體的種屬是否匹配,注意抗體不要長時間置于外面,用完后及時將其放入冰箱中,將抗體從冰箱中取出,進行混勻離心,計算樣本所需要的抗體量,用TBST進行稀釋,稀釋混勻注意不要用加樣槍吹打避免產生氣泡,抗體稀釋液一般加2ml,將nc膜用鑷子將有蛋白的一面孵到抗體稀釋液中,放入4℃冰箱中過夜。

 

9. 洗脫

  將孵育好的nc膜從孔槽中取出,放入裝有TBST的平皿中,脫色搖床以固定轉速清洗10分鐘,三次。注意膜不要層疊在一起。


10. 二抗

      將二抗從冰箱中取出,混勻離心,計算樣本所需要抗體量。用TBST稀釋,注意若按照稀釋比,抗體的量少于1ul,則要按照至少1ul的量來計算所需的TBST的量,放入孔槽中孵育一個小時。因大多數樣本的二抗是固定幾種,因此計算中總的二抗需用量,在離心管中進行稀釋,稀釋時注意不要用加樣槍進行吹打,避免產生氣泡。


11. 洗脫

  將孵育好的nc膜從孔槽中取出,放入裝有TBST的平皿中,脫色搖床以固定轉速清洗10分鐘,三次。注意膜不要層疊在一起。

 

12. ECL顯色

   將顯色液從冰箱拿出,注意避光,將A液,B液按照等體積混合,一般一張膜用量1ml,用槍均勻滴在膜表面,剪開一個自封袋,用鑷子把膜平整放在自封袋中,壓好,避免產生氣泡,放在光片夾中。


13. 曝光

      將裝有nc膜的光片夾拿到暗室中,避免有任何的光源,在暗室燈中剪裁大小合適的膠片,層疊三張于nc膜上,壓好,關上光片夾,計時20分鐘,曝光后,在暗室將光片夾打開,放入顯影液中靜置3分鐘后,放入定影液中清洗,此時曝光結束,出暗室,在清水下沖洗膠片。


14. 數據分析處理

     將曝光好的膠片進行分析,對比marker,觀察目的蛋白條帶是否出現,背景是否干凈,條帶差異是否真實符合邏輯,觀察內參條帶是否均一,在預實驗中摸清抗體的準確稀釋比,樣本是否可用,根據預實驗得出的結論,安排下一步的正式試驗,試驗情況良好,用掃描儀掃描膠片,根據內參條帶,計算灰度值,確定樣本組間灰度值的差異。


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