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microRNA qPCR kits

一、背景:

 

MicroRNAsmicroRNAs)是一種小的內源性非編碼RNA分子,大約由2125個核苷酸組成。這些小的microRNA通常靶向一個或者多個mRNA,通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表達。成熟的microRNA 的形成包含多個步驟。首先,microRNA 基因被轉錄成命名為pri-microRNA的初級轉錄物;動物pri-microRNA的第一次剪切位于細胞核內,產生大小為70個核苷酸左右并能形成莖-環結構的microRNA 前體,稱為pre-microRNA;第二次剪切位于細胞質中,pre-microRNA被剪切成21-25個核苷酸成熟的microRNA。

 

MicroRNA 自從1993年首次被報道以來,現已經被發現了3000多種,存在于人類和所有的模式生物中。MicroRNA 通過與mRNA3’ UTR 結合而介導翻譯水平的調控,也可通過與mRNA結合的互補程度決定microRNA將以何種機制發生作用;完全的互補引起與RNAi類似的作用,不完全互補則導致翻譯抑制作用。因此,研究microRNA對于深入探討生命現象的本質,解釋細胞行為和疾病發生機制,具有重要的理論意義;對于疾病的診斷、治療和預防具有潛在的實際應用價值。

 

關于microRNA:

圖1,pre-microRNA  microRNA 示意圖  

 

二、BioTNT microRNA qPCR(莖環法)引物試劑盒


microRNA由于長度太短,一般難以檢測。 BioTNT 研發 microRNA qPCR Detection System , 是專門用于microRNA 定量檢測的系統。

該microRNA檢測試劑盒microRNA qRT-PCR Detection Kit包括:

1.應用于microRNA的特異莖環逆轉錄系統、及其qPCR 反應特異microRNA的引物assay;

2.特異性的莖環逆轉錄引物和qPCR檢測上下游引物;

3.專門的PCR 熒光定量檢測系統;

//www.jxfkv.icu/incs/file/fckeditor/microRNA18(2).JPG      

優勢:


1. 應用莖環逆轉錄引物進行逆轉錄,可以區分成熟的microRNA和Pre microRNA;

2. 應用BioTNT  microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit,已經優化的適合特異莖環逆轉錄引物進行CDNA合成的protocol,用于120個microRNA樣本的已知第一鏈CDNA合成;

3. BioTNT 經驗證的特異性莖環系統assay 可以提供您最方便的實驗方案;采用了120Tests的包裝,方便您的實驗;

 

特征:


本方法可以采用經典的trizol法抽提得到的總RNA;

檢測的特異性:獨特的microRNA莖環逆轉錄引物的設計技術及其優化的反應體系避免了非特異性擴增、特別是Pre-microRNA的污染;

檢測分辨率高:該系統能分辨單堿基差異的microRNA;

一站式解決方案:BioTNT不僅提供檢測的試劑盒,還提供經驗證的人源、小鼠源、大鼠源的特異性microRNA assay;

檢測靈敏度高:可在低至pg級的總RNA中檢測到特異表達的microRNA;

 

說明


1.BioTNT  microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit已包含有檢測所需要的所有試劑, 客戶僅需要提供RNA及BioTNT 特異性莖環系統assay即可進行microRNA檢測;

2.我們提供的BioTNT 特異性莖環系統assay建議同BioTNT  microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit配套使用;

3.我們承諾推出的每個BioTNT 特異性莖環系統assay都提供利用BioTNT  microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit進行驗證的報告,其報告內容包括驗證流程、引物相應擴增曲線、融解曲線、及其推薦的反應條件, 同時還提供陽性的cDNA驗證模板,客戶可以參考此條件進行檢測實驗。

 

 

 

二、BioTNT  microRNA  qPCR(加尾法)檢測試劑盒:


示意圖:



MicroRNA由于長度太短,一般難以檢測。

BioTNT采用在microRNA的 3’末端通過Poly(A)Polymerase,使得microRNA 添加了polyA 尾, 再采用特別設計的biotnt  oligo(dt)- 通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應,最終生成microRNA對應的cDNA第一鏈,從而完成了microRNA的逆轉錄反應 。

 

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)包含microRNA 3’末端Poly(A)修飾過程和逆轉錄過程的所有試劑,該試劑盒具有高效的Poly(A)修飾和逆轉錄效率,可從20pg-1ug的總RNA中有效制備microRNA對應的cDNA第一鏈。

 

注:該試劑盒須與BioTNT microRNA熒光定量檢測試劑盒(A2030A202)配套使用。

 

品名

貨號

產品分類

品牌

規格

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

A2030A201

microRNA

BioTNT

25T

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

A2030A201X2

microRNA

BioTNT

50T

microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)

A2030A202

microRNA

BioTNT

100T

microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)

A2030A202X5

microRNA

BioTNT

500T

microRNA 加尾法引物(驗證)

CUS-PA-microRNA名稱

microRNA

BioTNT

500T

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

10*RT Primer

A2030A201-RT

microRNA

BioTNT

25T

 

說明

該試劑盒中包含microRNA熒光定量檢測的所有試劑,包括2×microRNA premix和Reverse primer set。2×microRNA premix是專門為microRNA檢測而研發的新一代熒光定量檢測試劑, 該檢測試劑采用premix預混系統,包含了優化配比的dNTP、增強劑、穩定劑等,且其中的DNA polymerase采用的是新一代化學修飾法的熱啟動技術,保證高特異性和高靈敏度。

 

NOTE加尾法的實驗的難點在于,同樣的一條QPCR 下游引物,與多達上千種的microRNA 設計出來的上游引物一起配對,會存在以下困難:

1.  TM 值適配的困難;高GC 或者低GC的microRNA 很難設計或者修飾上游引物;

2.  引物二聚體:同一條下游引物必然會與某些上游引物形成比較強的二聚體;

 

BioTNT 獨創加尾法Reverse primer set,為了讓您的加尾法QPCR進行得更順利 ,Biotnt microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)試劑盒中包括一系列的下游引物(退火溫度覆蓋10度),方便您優化整體的QPCR實驗。

 

這套加尾法QPCR Reverse primer set 為您提供了較高的上游引物設計靈活度,您的上游引物設計TM 值可以從58度到69度的范圍,都能找到適配的下游引物。同時,不同的下游引物與您設計的上游引物進行配對,您可以通過預實驗驗證,尋找更合適的上游引物和下游引物,適配率高達95%以上。

 

產品特點:

通量高:可用于從一個合成反應的cDNA中檢測多種microRNAs。

 

特異性:性能優良的化學熱啟動PCR聚合酶技術及其優化的反應體系避免了非特異性擴增。

 

保存條件: -20℃避光保存。

 

適用范圍:

對microRNA反轉錄后的cDNA進行熒光定量PCR檢測;

適用于各種類型熒光定量PCR儀

 

備注:

請與microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)A2030A201配套使用以達到最佳效果,若使用其它反轉錄試劑盒獲得的cDNA進行檢測,請咨詢BioTNT客服。

 

四、microRNA 加尾法引物(驗證)引物;

 

MicroRNAs(microRNAs)是一類由18~25核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA,具有表達的時序性、序列嚴格的保守性、組織器官表達量的相對特異性等特點,在細胞分化,生物發育及疾病發生發展過程中發揮巨大作用。

 

目前microRNA相關研究在迅速增減,為了方便客戶,我們推出了microRNA加尾法驗證引物。 驗證樣本microRNA mimics,經過BioTNT microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)A2030A201合成cDNA后,配合microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)A2030A202及試劑盒中的下游引物set進行熒光定量驗證。BioTNT 為您提供經設計并驗證的可用于加尾法實驗的引物,包括上游引物(實物),以及提供您最優的下游引物編號,方便您進行整體microRNA QPCR 實驗。訂購貨號為:CUS-PA-microRNA名稱。

 

所有引物規格均為  500次×20ul qPCR體系   

成品均為液體狀態10×  統一價格 240元/套


品名 貨號 特性 品牌 規格 價格
microRNA 莖環QPCR試劑盒 A2010A0801 BioTNT 120T ¥4030
¥3098
microRNA PCR premix A2030A002 BioTNT 20ul*100T ¥550
¥423
microRNA PCR premix A2030A002X10 BioTNT 20ul*1000T ¥3440
¥2649
microRNA PCR premix A2030A002X3 BioTNT 20ul*300T ¥1480
¥1137
microRNA 特異性莖環引物試劑盒 A2030A004 BioTNT 120T ¥850
¥652
microRNA 加尾法引物(驗證) A2030A005 BioTNT 200T ¥330
¥254
microRNA 內參莖環引物試劑盒 A2030A006 BioTNT 120T ¥830
¥636
microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法) A2030A202 BioTNT 100T ¥830
¥636
microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法) A2030A202X5 BioTNT 500T ¥3440
¥2650
aae-bantam-3p qPCR試劑盒 aae-bantam-3p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-bantam-5p qPCR試劑盒 aae-bantam-5p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-let-7 qPCR試劑盒 aae-let-7 BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-1 qPCR試劑盒 aae-miR-1 BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-10 qPCR試劑盒 aae-miR-10 BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-100 qPCR試劑盒 aae-miR-100 BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-1000 qPCR試劑盒 aae-miR-1000 BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-11-3p qPCR試劑盒 aae-miR-11-3p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-11-5p qPCR試劑盒 aae-miR-11-5p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-1174 qPCR試劑盒 aae-miR-1174 BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-1175-3p qPCR試劑盒 aae-miR-1175-3p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-1175-5p qPCR試劑盒 aae-miR-1175-5p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-12-3p qPCR試劑盒 aae-miR-12-3p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-124 qPCR試劑盒 aae-miR-124 BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-125-5p qPCR試劑盒 aae-miR-125-5p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
aae-miR-12-5p qPCR試劑盒 aae-miR-12-5p BioTNT 1 kits ¥4030
¥3098
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BioTNT microRNA QPCR 實驗相關產品訂購指南:

 

一、RNA 抽提:

經驗證,可以使用以下產品進行樣品RNA 抽提, RNA抽提質量符合QPCR Array實驗樣本質量要求:

品名

貨號

產品分類

品牌

規格

RNA提取試劑盒(Trizol法)

A2010A101

總RNA 抽提

BioTNT

100ml

RNA提取試劑盒(Trizol法)

A2010A102

總RNA 抽提

BioTNT

200ml

磁珠法RNA抽提試劑盒(組織/細胞)

A2010A103

總RNA 抽提

BioTNT

50T

磁珠法RNA抽提試劑盒(血液,體液)

A2010A104

總RNA 抽提

BioTNT

50T

磁珠法RNA抽提試劑盒(酵母細胞)

A2010A105

總RNA 抽提

BioTNT

50T

miRNeasy Serum/Plasma Kit(50)

217184

microRNA 抽提

Qiagen

50T

miRNeasy FFPE kit(50)

217504

microRNA 抽提

Qiagen

50T

RNeasy Micro Kit(50)

74004

microRNA 抽提

Qiagen

50T

RNase-Free DNase Set (50)

79254

RNA 抽提

Qiagen

50T

 

請根據您的樣本選擇抽提試劑盒;無論您是否采用bioTNT 提供的抽提試劑盒,建議您在進行逆轉錄和QPCR實驗前進行RNA 和CDNA 樣品質量驗證;驗證方式見附錄;

 

二、逆轉錄和QPCR實驗:

BioTNT 針對microRNA的特點,開發了兩類試劑盒,一類為特異性莖環法microRNA 檢測試劑盒,一類為加尾法microRNA 檢測試劑盒

 

特異性莖環法microRNA 檢測

加尾法microRNA 檢測

原理

采用特異性莖環法逆轉錄,一份樣本一次僅轉錄出一種microRNA

采用polyA 加尾進行逆轉錄,一份樣本一次轉錄德所有microRNA

適用

microRNA 檢測,分子數量少于20個,含量中低的分子

microRNA 檢測,可以進行初篩

是否可用于PCR Array

不可

靈敏度

靈敏度高

靈敏度中等,中強表達基因可檢測,弱基因比較難

特異性

特異性高

特異性中等

是否可以檢測多基因

一份RNA 20ul,1ug/ul)可以檢測約20microRNA

一份RNA 20ul,1ug/ul)可以檢測超過100microRNA

操作

一次逆轉錄僅一種microRNA, 多分子操作比較繁瑣

一次逆轉錄多種microRNA

根據您的樣本數量,和檢測的分子數量,您可以選擇莖環法或者加尾法;

您也可以選擇加尾法先進行初篩,含量比較低的再用莖環法進行檢測。

 

三. 莖環法特異性逆轉錄和QPCR 試劑盒:

 

根據您的樣本數量,您可以購買以下組合:

品名

貨號

產品分類

品牌

規格

microRNA 莖環QPCR試劑盒

根據指標查詢

microRNA

BioTNT

120T

microRNA 特異性莖環引物試劑盒

根據指標查詢

microRNA

BioTNT

120T

microRNA 內參莖環引物試劑盒

根據指標查詢

microRNA

BioTNT

120T

 

舉例:

其中,1個microRNA 莖環QPCR試劑盒包括120T逆轉錄試劑盒,一個目的microRNA 引物試劑盒(含莖環逆轉錄引物+QPCR 上游引物+QPCR 下游引物),附送1個內參microRNA引物試劑盒,10ul*400T  QPCR premix。

如果您要檢測30份樣本,2個microRNA,1個內參,您可以這樣購買: 1個 microRNA 完整試劑盒+1個microRNA 引物試劑盒;

 

您也可以分開購買:

品名

貨號

產品分類

品牌

規格

microRNA 莖環QPCR試劑盒

根據指標查詢

microRNA

BioTNT

120T

microRNA逆轉錄試劑盒(莖環法)

A2030A001

microRNA

BioTNT

120T

microRNA逆轉錄試劑盒(莖環法)

A2030A001X3

microRNA

BioTNT

360T

microRNA 特異性莖環引物試劑盒

根據指標查詢

microRNA

BioTNT

120T

microRNA 內參莖環引物試劑盒

根據指標查詢

microRNA

BioTNT

120T

microRNA PCR premix

A2030A002

microRNA

BioTNT

1ml(20ul*100T)

microRNA PCR premix

A2030A002X3

microRNA

BioTNT

3ml(20ul*300T)

microRNA PCR premix

A2030A002X10

microRNA

BioTNT

10ml(20ul*100T)

 

根據您的樣品數量,選擇試劑盒的規格;可以在RNA 驗證合格后先小批量逆轉錄樣本,并進行樣本質量驗證;質量合格后進行QPCR實驗;

 

 

附件:

樣品質量驗證:

為了保證microRNA QPCR實驗的質量,建議在使用前先進行樣本質量驗證;

RNA 定量與質量控制

 

A.使用無菌水(RNase-free)稀釋 RNA 樣本,檢測 260  nm 和 280  nm 吸光值,A260/280 應大于 1.8。

 

B.使用公式A260× 40 ×稀釋倍數  = XXXXμg/mL 計算 RNA 濃度。

 

C.使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性。

 

D.建議:RNA質量測定后,逆轉錄得到cDNA,建議用多個內參基因自行驗證cDNA質量;

 

推薦購買BioTNT的 microRNA 內參引物試劑盒;進行樣本CDNA 質量驗證;

 

推薦:

RNU6B microRNA human 內參real time PCR檢測試劑盒

RNU6 microRNA human 內參real time PCR檢測試劑盒

RNU48 microRNA human 內參real time PCR檢測試劑盒

Rnu6B microRNA mouse 內參real time PCR 檢測試劑盒

snoRNA202 microRNA mouse 內參real time PCR檢測試劑盒

Rnu6B microRNA rat 內參real time PCR 檢測試劑盒

U87 microRNA rat 內參real time PCR檢測試劑盒

 

如果是血清中的microRNA, 建議使用microRNA 16作為內參。

 

三、加尾法microRNA 檢測試劑盒 :

BioTNT 為您提供QPCR 相關的所有試劑:

 

品名

貨號

產品分類

品牌

規格

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

A2030A201

microRNA

BioTNT

25T

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

A2030A201X2

microRNA

BioTNT

50T

microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)

A2030A202

microRNA

BioTNT

100T

microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)

A2030A202X5

microRNA

BioTNT

500T

microRNA 加尾法引物(驗證)

microRNA

BioTNT

200T

 

舉例:如果您有20個樣本,5個目的microRNA, 1個內參,雙重復實驗,您可以購買1個microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法),25T ,1個microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法),500T;以及5個microRNA 加尾法驗證引物。

 

附件:

樣品質量驗證:

為了保證microRNA QPCR實驗的質量,建議在使用前先進行樣本質量驗證;

RNA 定量與質量控制

 

A.使用無菌水(RNase-free)稀釋 RNA 樣本,檢測 260  nm 和 280  nm 吸光值,A260/280 應大于 1.8。

 

B.使用公式A260× 40 ×稀釋倍數  = XXXXμg/mL 計算 RNA 濃度。

 

C.使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性。

 

D.建議:RNA質量測定后,逆轉錄得到cDNA,建議用多個內參基因自行驗證cDNA質量;

 

推薦購買BioTNT的 microRNA 內參引物試劑盒;進行樣本CDNA 質量驗證;

 

推薦:

RNU6B microRNA human 內參real time PCR檢測試劑盒

RNU6 microRNA human 內參real time PCR檢測試劑盒

RNU48 microRNA human 內參real time PCR檢測試劑盒

Rnu6B microRNA mouse 內參real time PCR 檢測試劑盒

snoRNA202 microRNA mouse 內參real time PCR檢測試劑盒

Rnu6B microRNA rat 內參real time PCR 檢測試劑盒

U87 microRNA rat 

 

如果是血清中的microRNA, 建議使用microRNA 16作為內參。

 


BioTNT 五年QPCR microRNA QPCR  檢測傾情服務!  優質服務品質回報社會!

BioTNT 生物技術服務部自從2005年成立以來,承接了超過200個QPCR microRNA 技術服務項目,積累了廣泛的QPCR 定量檢測的經驗。 
 
一、簡介: 關于microRNA
     MicroRNAs(miRNAs)是一種小的內源性非編碼RNA分子,大約由21-25個核苷酸組成。這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA,通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表達。成熟的microRNA 的形成包含多個步驟。首先,microRNA 基因被轉錄成命名為pri-microRNA 的初級轉錄物;動物pri-microRNA的第一次剪切位于細胞核內,產生大小為70個核苷酸左右并能形成莖-環結構的microRNA 前體,稱為pre-microRNA;第二次剪切位于細胞質中,pre-microRNA被剪切成21-25個核苷酸成熟的microRNA。
     MicroRNA 自從1993年首次被報道以來,現已經被發現了3000多種,存在于人類和所有的模式生物中。MicroRNA 通過與mRNA的3’ UTR 結合而介導翻譯水平的調控,也可通過與mRNA結合的互補程度決定microRNA將以何種機制發生作用;完全的互補引起與RNAi類似的作用,不完全互補則導致翻譯抑制作用。因此,研究microRNA對于深入探討生命現象的本質,解釋細胞行為和疾病發生機制,具有重要的理論意義;對于疾病的診斷、治療和預防具有潛在的實際應用價值。

    關于microRNA:

圖1,pre-microRNA 和 microRNA 示意圖
 
MicroRNA由于長度太短,一般難以檢測。
 
二、BioTNT miRNA qPCR Detection System 介紹
 
BioTNT 生物技術部推出了 miRNA qPCR Detection System , 是專門用于miRNA 定量檢測的系統。該系統包括:
·                 miRNA檢測試劑盒miRNA qRT-PCR Detection Kit:
  • 應用于miRNA的特異莖環逆轉錄系統、及其qPCR 反應特異miRNA的引物assay:
  • 特異性的莖環逆轉錄引物和qPCR檢測上下游引物。

      

特點:

  • 1.   應用莖環逆轉錄引物進行逆轉錄,可以區分成熟的microRNA和premicroRNA;
    2.   應用BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit,已經優化的適合特異莖環逆轉錄引物進行CDNA 合成的protocol,用于100個microRNA樣本的已知第一鏈CDNA合成;
    3.   BioTNT 經驗證的特異性莖環系統assay 可以提供您最方便的實驗方案;采用了100Tests的包裝,方便您的實驗;
     
    產品特征:
    ² 本方法可以采用經典的trizol法抽提得到的總RNA;
    ² 檢測的特異性:獨特的miRNA莖環逆轉錄引物的設計技術及其優化的反應體系避免了非特異性擴增、特別是Pre-miRNA的污染;
    ² 檢測分辨率高:該系統能分辨單堿基差異的miRNA;
    ² 一站式解決方案:BioTNT不僅提供檢測的試劑盒,還提供經驗證的人源、小鼠源、大鼠源的特異性microRNA assay;
    ² 檢測靈敏度高:可在低至pg級的總RNA中檢測到特異表達的miRNA;
    質量說明
  • BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit已包含有檢測所需要的所有試劑, 客戶僅需要提供RNA及BioTNT 特異性莖環系統assay即可進行miRNA檢測;
  • 我們提供的BioTNT 特異性莖環系統assay建議同BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit配套使用;
  • 我們承諾推出的每個BioTNT 特異性莖環系統assay都提供利用BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit進行驗證的報告,其報告內容包括驗證流程、引物相應擴增曲線、融解曲線、及其推薦的反應條件, 同時還提供陽性的cDNA驗證模板,客戶可以參考此條件進行檢測實驗。

 

三、BioTNT QPCR microRNA 樣本準備  
 
3.1 組織樣本準備
 
  注意:BioTNT QPCR microRNA 檢測的樣本取樣同Real time PCR的組織取樣與保存:
1、 取動物的組織,動作要求迅速,盡量避免樣本在環境中暴露太久;
2、 講樣本迅速放入無菌無酶的凍存管中,為保證質量,推薦選取Axygen,corning,nunc等國外品牌的凍存管;根據組織塊的大小,確定RNA 抽提方式;如果組織塊非常小,建議采用柱抽提試劑盒進行抽提( RNeasy Micro Kit(50) 74004 ),此時樣本中不要加入trizol;如果組織塊有100mg,可以采用trizol 法抽提總RNA的方式(RNA提取試劑盒(Trizol 法) A2010B0A01),進行樣本的保存,在樣本中加入1ml trizol 浸沒樣本;
3、 在凍存管上做好標記,盡量清晰易辨;在實驗記錄本上做好記錄,盡量詳細易查;
4、 將凍存管直接放入液氮中速凍;或加入1ml Trizol 到凍存管中,再放入液氮速凍;
5、 速凍2h 后,將凍存管從液氮轉至-80度冰箱,可以保存6個月左右;
 
BioTNT QPCR microRNA 的細胞取樣與保存
1、 懸浮細胞:500g 離心5min 取細胞,用PBS 清洗2-3遍,得細胞,并轉至放入凍存管中;
2、 根據細胞量進行后續抽提方式的選擇,如果細胞量大于5*10的5次方,可以采用trizol 方式進行總RNA 抽提,如果小于此量,建議采用Qiagen的柱式抽提( RNeasy Micro Kit(50) 74004 
);可以采用trizol 抽提的客戶,可在樣本中加入500ul Trizol 到凍存管中,吹打混勻(RNA提取試劑盒(Trizol 法) A2010B0A01);
3、 在凍存管上做好標記,盡量清晰易辨;在實驗記錄本上做好記錄,盡量詳細易查;
4、 將凍存管放入液氮速凍,2h 后,轉至-80度冰箱,可以保存6個月左右;
 
樣本運輸:干冰運輸
 
3.3  血清/血漿樣本準備:
建議采用血漿樣本,可以得到相對更好的實驗結果。
使用抗凝管采集全血,并盡快進行血漿分離:1000g離心10分鐘,分離血漿和細胞組分。(注意:血漿收集應使用抗凝管,抗凝劑可以用檸檬酸鈉或EDTA等,但一定不要使用肝素抗凝,因為肝素對后續實驗有較大影響。)將采集好的血漿轉移至單獨的凍存管,按照每400-500ul/管分裝好。
短期保存,可放入-20℃或-70℃冰箱。長期保存,請放入液氮。
 
3.4  全血樣本準備:
請按照實際使用的收集方法,如注射器收集或真空收集管等,參考相應的廠商提供產品說明進行操作。
采集好全血,將采集好的全血轉移至單獨的凍存管,按照每500ul/管分裝好。
短期保存,可放入-20℃或-70℃冰箱。長期保存,請放入液氮。
 
 
3.5  石蠟樣本準備:
石蠟切片,至少三片;或者提供石蠟塊,常溫保存。
 
 
、BioTNT QPCR microRNA 檢測使用的儀器
 
進行檢測使用的主要儀器為QPCR, BioTNT 使用life technology最新款的ViiA™ 7實時熒光定量PCR系統進行microRNA的QPCR 檢測。
 
ViiA™ 7實時熒光定量PCR系統在單一的高性能儀器上融合了您需要的所有實時熒光定量PCR特性,從而幫助您優化研究效率。ViiA™7系統具有簡單的工作流程、直觀的軟件、觸控屏界面以及使誤操作降至最少的單鍵實驗方案,可提供出眾的重復性和最小的孔間和儀器間差異。

產率
ViiA™ 7系統適用于中等至高通量實時熒光定量PCR,可提升您的實驗室效率。
快速的加熱塊更換——前開門設計使熱循環加熱??櫚母槐淶酶菀?,無需移動旁邊的設備,如機械臂或計算機
簡單的觸摸屏界面——儀器觸摸屏提供了一鍵式實驗方案,可快速簡單地完成各種應用Assay的設置
自動化兼容性——ViiA™ 7系統結合了Applied Biosystems® Twister® II 機器人,使您在自動化環境下實現效率最大化

整合
可與TaqMan® Array微流體芯片和 Applied Biosystems® TaqMan® Assay完全兼容:實時熒光定量PCR分析的金標準,具有高靈敏度、高特異性和寬動態范圍。
384 孔通量且無需機器輔助——采用TaqMan® Array微流體芯片,無需移液機器人或復雜的移液裝置;只需加入您的樣本和預混液,即可在ViiA™ 7系統上運行
與全套 TaqMan® Assay 兼容——ViiA™ 7系統已經過優化,可用于所有TaqMan® Assay(包括 MicroRNA、蛋白質、非編碼 RNA 和Pri-miRNA Assay),從而獲得清晰簡潔的數據

性能
ViiA™ 7系統具有下列特點:
OptiFlex® 系統——增強型熒光檢測,可實現準確且靈敏的數據分析
最大程度的多重分析能力——6 個可自由組合的激發和發射濾光片通道,可實現最多的染料組合和最大的多重反應能力
靈活的數據采集——多種升降溫方法檢測形式為升降溫階段的熒光數據采集提供了更多的靈活性
精確定量——在單色反應中可檢測出低至1.5倍的拷貝數差異

ViiA™ 7軟件具有:
直觀的界面和創新的設計
便捷的自動化操作
更強大的數據分析
與高通量完全兼容

可擴展的軟件構架
提供可選的附加性能,可升級至現有軟件。
遵循美國聯邦法規第21章第11節(21 CFR Part 11)——可選的SAE???,提供記錄安全、審計和電子簽名信息,從而實現全方位的數據可追溯性
高分辨率熔解曲線(HRM)——采用內置的MeltDoctor™ 實驗方案和校準,您可以縮短優化運行的時間,從而將更多的時間用于分析您的結果。通過方便的軟件設置即可根據需要設置基因型種類的數目。

 

儀器圖片:

 
 
 
五、BioTNT QPCR microRNA 檢測標準服務流程
 
BioTNT  microRNA 檢測技術服務標準流程:
1、 客戶提供樣本(組織,細胞或者RNA),請參照取樣與保存;
2、 客戶提供檢測指標;
3、與客戶協商內參的選?。ㄈ?,大鼠,小鼠均有兩種內參可以采用);
4、采用 BioTNT  PCRmiRNA qPCR Detection System ;
5、客戶樣本驗證進行抽提,特異性逆轉錄,QPCR 檢測,驗證系統是否好用;
6、 客戶的大批量樣本進行處理,抽提和實驗。
 
實驗對象為組織樣品,組織量不是很少的情況下,可以采用trizol 法進行抽提。取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿后抽提RNA。
實驗對象為細胞樣品,細胞數量不是很少的情況下,可以采用trizol 法進行抽提。每份樣品取1×106~1×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。
 
組織塊少或者細胞量小的時候,采用Qiagen 柱式抽提(RNeasy Micro Kit(50) 74004 )。費用為120元/個;
 
血液樣本,如血漿或者血清,采用Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit(50)217184 ,費用為140元/個;
石蠟樣本,采用miRNeasy FFPE kit(50)217504,費用為160元/個;
 
7、 RNA 特異性逆轉錄得到內參CDNA, 對樣本的質量進行驗證;
8、 大批量樣本real time PCR實驗;使用儀器為:ABI 公司的Vii7;
9、 靶基因表達水平結果分析,數據分析方法為:delta delta CT 法;也可以采用相對定量的標準曲線法;
10、 提供客戶實驗報告;包括方法,材料,設備,原始數據和計算數據的成套材料;
 
 
六、BioTNT real time PCR 檢測技術服務收費標準

實驗步驟
 
組織或細胞總RNA抽提   80元(trizol抽提microRNA,一個組織或細胞標本);
離心柱式抽提費用細胞/組織 120元/樣;
血清/血漿 140元/樣;
石蠟切片 160元/樣

 特異性逆轉錄+目的基因實時定量PCR    數據分析   雙重復數據120元(一個標本一個指標),三重復數據160元 (內參同樣按照目的基因收費)

引物等費用涵蓋在這里面;

 如需制備標準曲線,收取標準曲線制備費用200元/一個基因

 一次取樣,超過3個,免費;小于等于3個樣品, 上海市區收取20元/次的取樣費用;上海郊區,不上門取樣;

外地郵寄費用自理;

全套技術服務
您只需提供組織或細胞標本,我們為您完成RNA抽提,cDNA制備,實時定量PCR,標準曲線制備及數據分析的所有步驟。
 

【您只需提供】

組織
或,高濃度的Total RNA
◇microRNA 名稱
 
【我們向您提供】 
實驗材料、儀器、方法、步驟
供發表的引物序列、擴增曲線、熔解曲線
原始實驗數據和計算好的正式實驗數據
免費實驗培訓、技術支持
 
 

 

BioTNT 五年QPCR microRNA QPCR  檢測傾情服務!  優質服務品質回報社會!

BioTNT 推出microRNA 加尾法檢測試劑盒和相關技術服務!適用于microRNA 多基因檢測/PCR Array

BioTNT 生物技術服務部自從2005年成立以來,承接了超過200QPCR microRNA 技術服務項目,積累了廣泛的QPCR 定量檢測的經驗。


一、簡介: 關于microRNA

 

MicroRNAs(microRNAs)是一種小的內源性非編碼RNA分子,大約由21-25個核苷酸組成。這些小的microRNA通常靶向一個或者多個mRNA,通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表達。成熟的microRNA 的形成包含多個步驟。首先,microRNA 基因被轉錄成命名為pri-microRNA 的初級轉錄物;動物pri-microRNA的第一次剪切位于細胞核內,產生大小為70個核苷酸左右并能形成莖-環結構的microRNA 前體,稱為pre-microRNA;第二次剪切位于細胞質中,pre-microRNA被剪切成21-25個核苷酸成熟的microRNA。

 

MicroRNA 自從1993年首次被報道以來,現已經被發現了3000多種,存在于人類和所有的模式生物中。MicroRNA 通過與mRNA的3’ UTR 結合而介導翻譯水平的調控,也可通過與mRNA結合的互補程度決定microRNA將以何種機制發生作用;完全的互補引起與RNAi類似的作用,不完全互補則導致翻譯抑制作用。因此,研究microRNA對于深入探討生命現象的本質,解釋細胞行為和疾病發生機制,具有重要的理論意義;對于疾病的診斷、治療和預防具有潛在的實際應用價值。

 

關于microRNA:

圖1,pre-microRNA 和 microRNA 示意圖 MicroRNA由于長度太短,一般難以檢測。

二、microRNA 檢測路線的選擇:


BioTNT 針對microRNA的特點,開發了兩類試劑盒,一類為特異性莖環法microRNA 檢測試劑盒,一類為加尾法microRNA 檢測試劑盒

 

特異性莖環法microRNA 檢測

加尾法microRNA 檢測

原理

采用特異性莖環法逆轉錄,一份樣本一次僅轉錄出一種microRNA

采用polyA 加尾進行逆轉錄,一份樣本一次轉錄德所有microRNA

適用

microRNA 檢測,分子數量少于20個,含量中低的分子

microRNA 檢測,可以進行初篩

是否可用于PCR Array

不可

靈敏度

靈敏度高

靈敏度中等,中強表達基因可檢測,弱基因比較難

特異性

特異性高

特異性中等

是否可以檢測多基因

一份RNA 20ul,1ug/ul)可以檢測約20microRNA

一份RNA 20ul,1ug/ul)可以檢測超過100microRNA

操作

一次逆轉錄僅一種microRNA, 多分子操作比較繁瑣

一次逆轉錄多種microRNA

根據您的樣本數量,和檢測的分子數量,您可以選擇莖環法或者加尾法;

也可以選擇加尾法先進行初篩,含量比較低的再用莖環法進行檢測。


BioTNT microRNA 加尾法qPCR Detection System 介紹示意圖:

      

二、BioTNT  推出microRNA 加尾法檢測試劑盒:

示意圖:



MicroRNA由于長度太短,一般難以檢測。

 

BioTNT采用在microRNA的 3’末端通過Poly(A)Polymerase,使得microRNA 添加了polyA 尾, 再采用特別設計的biotnt  oligo(dt)- 通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應,最終生成microRNA對應的cDNA第一鏈,從而完成了microRNA的逆轉錄反應 。

 

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)包含microRNA 3’末端Poly(A)修飾過程和逆轉錄過程的所有試劑,該試劑盒具有高效的Poly(A)修飾和逆轉錄效率,可從20pg-1ug的總RNA中有效制備microRNA對應的cDNA第一鏈。

 

注:該試劑盒須與BioTNT microRNA熒光定量檢測試劑盒(A2030A202)配套使用。

 

品名

貨號

產品分類

品牌

規格

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

A2030A201

microRNA

BioTNT

25T

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

A2030A201X2

microRNA

BioTNT

50T

microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)

A2030A202

microRNA

BioTNT

100T

microRNA熒光定量檢測試劑盒(加尾法)

A2030A202X5

microRNA

BioTNT

500T

microRNA 加尾法引物(驗證)

CUS-PA-microRNA名稱

microRNA

BioTNT

500T

microRNA逆轉錄試劑盒(加尾法)

10*RT Primer

A2030A201-RT

microRNA

BioTNT

25T

 

三、BioTNT QPCR microRNA 樣本準備   

 3.1 組織樣本準備

 

注意:BioTNT QPCR microRNA 檢測的樣本取樣同Real time PCR的組織取樣與保存:

1、取動物的組織,動作要求迅速,盡量避免樣本在環境中暴露太久;

2、講樣本迅速放入無菌無酶的凍存管中,為保證質量,推薦選取Axygen,corning,nunc等國外品牌的凍存管;根據組織塊的大小,確定RNA 抽提方式;如果組織塊非常小,可以采用磁珠法RNA抽提試劑盒(組織/細胞)A2010A103進行抽提;也可以采用柱抽提試劑盒進行抽提( RNeasy Micro Kit50 74004 ),此時樣本中不要加入trizol;如果組織塊有100mg,可以采用trizol 法抽提總RNA的方式(RNA提取試劑盒(Trizol ) A2010B0A01),進行樣本的保存,在樣本中加入1ml trizol 浸沒樣本;

3、在凍存管上做好標記,盡量清晰易辨;在實驗記錄本上做好記錄,盡量詳細易查;

4、將凍存管直接放入液氮中速凍;或加入1ml Trizol 到凍存管中,再放入液氮速凍;

5、速凍2h 后,將凍存管從液氮轉至-80度冰箱,可以保存6個月左右;

 

BioTNT QPCR microRNA 的細胞取樣與保存

1、懸浮細胞:500g 離心5min 取細胞,用PBS 清洗2-3遍,得細胞,并轉至放入凍存管中;

2、根據細胞量進行后續抽提方式的選擇,如果細胞量大于5*105次方,可以采用trizol 方式進行總RNA 抽提,如果小于此量,可以采用磁珠法RNA抽提試劑盒(組織/細胞)A2010A103進行抽提,或者采用Qiagen的柱式抽提( RNeasy Micro Kit50 74004 );可以采用trizol 抽提的客戶,可在樣本中加入500ul Trizol 到凍存管中,吹打混勻(RNA提取試劑盒(Trizol ) A2010B0A01);

3、在凍存管上做好標記,盡量清晰易辨;在實驗記錄本上做好記錄,盡量詳細易查;

4、將凍存管放入液氮速凍,2h 后,轉至-80度冰箱,可以保存6個月左右;

 

樣本運輸:干冰運輸

 

3.3  血清/血漿樣本準備:

建議采用血漿樣本,可以得到相對更好的實驗結果。

使用抗凝管采集全血,并盡快進行血漿分離:1000g離心10分鐘,分離血漿和細胞組分。(注意:血漿收集應使用抗凝管,抗凝劑可以用檸檬酸鈉或EDTA等,但一定不要使用肝素抗凝,因為肝素對后續實驗有較大影響。)將采集好的血漿轉移至單獨的凍存管,按照每400-500ul/管分裝好。
短期保存,可放入-20-70冰箱。長期保存,請放入液氮。

 

3.4  全血樣本準備:

請按照實際使用的收集方法,如注射器收集或真空收集管等,參考相應的廠商提供產品說明進行操作。
采集好全血,將采集好的全血轉移至單獨的凍存管,按照每500ul/管分裝好。
短期保存,可放入-20-70冰箱。長期保存,請放入液氮。

 

 

3.5  石蠟樣本準備:

石蠟切片,至少三片;或者提供石蠟塊,常溫保存。

 3.5  石蠟樣本準備:石蠟切片,至少三片;或者提供石蠟塊,常溫保存。 


、BioTNT QPCR microRNA 檢測使用的儀器

進行檢測使用的主要儀器為QPCR, BioTNT 使用life technology最新款的ViiA? 7實時熒光定量PCR系統進行microRNA的QPCR 檢測。 ViiA? 7實時熒光定量PCR系統在單一的高性能儀器上融合了您需要的所有實時熒光定量PCR特性,從而幫助您優化研究效率。ViiA?7系統具有簡單的工作流程、直觀的軟件、觸控屏界面以及使誤操作降至最少的單鍵實驗方案,可提供出眾的重復性和最小的孔間和儀器間差異。

產率
ViiA? 7系統適用于中等至高通量實時熒光定量PCR,可提升您的實驗室效率。
快速的加熱塊更換——前開門設計使熱循環加熱??櫚母槐淶酶菀?,無需移動旁邊的設備,如機械臂或計算機
簡單的觸摸屏界面——儀器觸摸屏提供了一鍵式實驗方案,可快速簡單地完成各種應用Assay的設置
自動化兼容性——ViiA? 7系統結合了Applied Biosystems? Twister? II 機器人,使您在自動化環境下實現效率最大化

 

整合
可與TaqMan? Array微流體芯片和 Applied Biosystems? TaqMan? Assay完全兼容:實時熒光定量PCR分析的金標準,具有高靈敏度、高特異性和寬動態范圍。
384 孔通量且無需機器輔助——采用TaqMan? Array微流體芯片,無需移液機器人或復雜的移液裝置;只需加入您的樣本和預混液,即可在ViiA? 7系統上運行
與全套 TaqMan? Assay 兼容——ViiA? 7系統已經過優化,可用于所有TaqMan? Assay(包括 MicroRNA、蛋白質、非編碼 RNA 和Pri-microRNA Assay),從而獲得清晰簡潔的數據

 

性能
ViiA? 7系統具有下列特點:
OptiFlex? 系統——增強型熒光檢測,可實現準確且靈敏的數據分析
最大程度的多重分析能力——6 個可自由組合的激發和發射濾光片通道,可實現最多的染料組合和最大的多重反應能力
靈活的數據采集——多種升降溫方法檢測形式為升降溫階段的熒光數據采集提供了更多的靈活性
精確定量——在單色反應中可檢測出低至1.5倍的拷貝數差異

 

ViiA? 7軟件具有:
直觀的界面和創新的設計
便捷的自動化操作
更強大的數據分析
與高通量完全兼容

 

可擴展的軟件構架
提供可選的附加性能,可升級至現有軟件。
遵循美國聯邦法規第21章第11節(21 CFR Part 11)——可選的SAE???,提供記錄安全、審計和電子簽名信息,從而實現全方位的數據可追溯性
高分辨率熔解曲線(HRM)——采用內置的MeltDoctor? 實驗方案和校準,您可以縮短優化運行的時間,從而將更多的時間用于分析您的結果。通過方便的軟件設置即可根據需要設置基因型種類的數目。

 

儀器圖片:


   五、BioTNT QPCR microRNA 檢測標準服務流程

 BioTNT  microRNA 檢測技術服務標準流程:1、 客戶提供樣本(組織,細胞或者RNA),請參照取樣與保存;2、 客戶提供檢測指標;3、與客戶協商內參的選?。ㄈ?,大鼠,小鼠均有兩種內參可以采用);4、采用 BioTNT  PCRmicroRNA qPCR Detection System ;5、客戶樣本驗證進行抽提,特異性逆轉錄,QPCR 檢測,驗證系統是否好用;6、 客戶的大批量樣本進行處理,抽提和實驗。 實驗對象為組織樣品,組織量不是很少的情況下,可以采用trizol 法進行抽提。取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿后抽提RNA。 
實驗對象為細胞樣品,細胞數量不是很少的情況下,可以采用trizol 法進行抽提。每份樣品取1×106~1×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。 

 

 

組織塊少或者細胞量小的時候,采用Qiagen 柱式抽提(RNeasy Micro Kit(50) 74004 )。費用為120元/個; 血液樣本,如血漿或者血清,采用Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit(50)217184 ,費用為140元/個;石蠟樣本,采用miRNeasy FFPE kit(50)217504,費用為160元/個;

 

7、 RNA 特異性逆轉錄得到內參CDNA, 對樣本的質量進行驗證;8、 大批量樣本real time PCR實驗;使用儀器為:ABI 公司的Vii7;9、 靶基因表達水平結果分析,數據分析方法為:delta delta CT 法;也可以采用相對定量的標準曲線法;10、 提供客戶實驗報告;包括方法,材料,設備,原始數據和計算數據的成套材料;

六、BioTNT microRNA 加尾法 QPCR 檢測技術服務收費標準

 實驗步驟

 

組織或細胞總RNA抽提   80(trizol抽提microRNA,一個組織或細胞標本);

離心柱式抽提費用細胞/組織 120/樣;

血清/血漿 140/樣;

石蠟切片 160/

逆轉錄費用為120/樣本;

目的基因實時定量PCR 數據分析 雙重復數據60(一個標本一個指標),三重復數據80 (內參按照目的基因的一半進行收費)

引物等費用涵蓋在這里面;

 如需制備標準曲線,收取標準曲線制備費用200/一個基因

 一次取樣,超過3個,免費;小于等于3個樣品, 上海市區收取100/次的干冰取樣費用;上海郊區,不上門取樣;

外地郵寄費用自理;

 全套技術服務
您只需提供組織或細胞標本,我們為您完成RNA抽提,cDNA制備,實時定量PCR,標準曲線制備及數據分析的所有步驟。

 

【您只需提供】

 組織

 或,高濃度的Total RNA
microRNA 名稱

 

【我們向您提供】 

 

 實驗材料、儀器、方法、步驟
 供發表的引物序列、擴增曲線、熔解曲線
 原始實驗數據和計算好的正式實驗數據
 免費實驗培訓、技術支持

 


資料名稱 資料描述 下載
A2030A001microPNA逆轉錄試劑盒(莖環法) A2030A001microPNA逆轉錄試劑盒(莖環法) 請先登錄
A2030A002 microRNA PCR premix 說明書 A2030A002 microRNA PCR premix 說明書 請先登錄
A2030A003 microRNA qRT-PCR syb kit-2018說明書 A2030A003 microRNA qRT-PCR syb kit-2018說明書 請先登錄
Manual BioTNT 莖環法microRNA qRT-PCR 試劑盒使用說明 Manual BioTNT 莖環法microRNA qRT-PCR 試劑盒使用說明 請先登錄
數據報告說明——qPCR篇 下載BioTNT的PCR數據后,如何解讀并運用數據進行統計呢?
BioTNT提供數據報告說明書為您解惑。
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BioTNT PCR數據報告模版 BioTNT 提供給客戶的數據報告模版 請先登錄
BioTNT qPCR 結果判斷和數據計算 如何用實驗數據判斷引物的好壞?
如何通過實驗數據進行預實驗判斷?
如何正確導出正式實驗數據?
如何計算正式實驗數據?
請先登錄
BioTNT qPCR 實驗步驟PPT PPT介紹了Real time PCR實驗原理、實驗步驟,引物設計以及操作注意事項和數據處理。 請先登錄
BioTNT qPCR 實驗路線PPT 介紹了QPCR 的實驗路線,染料或者探針,AQ 或者RQ的定義和選擇 請先登錄
BioTNT qPCR 基因序列與引物 PPT 介紹了如何查找基因,如何判斷引物的好壞以及blast 請先登錄
Analysis of Relative Gene Expression Data Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method, 相對定量經典文獻 請先登錄
如何應用BioTNT 提供的real time PCR數據進行統計計算示例 采用了BioTNT QPCR 相對定量服務,得到數據后,如何利用數據進行進一步分析呢?BioTNT 為您提供了進一步統計的示例,方便指導您進行下一步的數據統計。 請先登錄
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1. 搜索產品時先要選擇搜索條件:品名搜索和貨號搜索,搜索到產品列表時,可根據產品類別和品牌進行一次篩??;
2. 由于某些產品的英文名較多,可更換關鍵詞搜索;
3. 當進行品名搜索時,切勿將品名和種類同時輸入,否則就有可能搜索不到產品(例如:FAST Frame for Chip Kits - 4 Slide frame 生物芯片,將有可能搜索不到產品或者過多的產品);
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